组成图示
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传感器类型
压电(QCM)生物传感器
检测对象
cryptogein 受体结合位点（cryptogein receptor binding sites，烟草质膜受体）；样品基质：烟草质膜囊泡/膜蛋白溶液（tobacco plasma membrane vesicles）
检测原理
传感表面先以半胱胺自组装层和戊二醛共价固定 cryptogein，使其作为配体捕获溶液中的烟草质膜囊泡受体。当含受体的膜囊泡流经 QCM 表面时，囊泡引入首先引起体相粘度变化，产生快速频率偏移；随后 cryptogein 与膜受体结合，使表面质量与界面粘弹性增加，引起频率下降。结合过程可用 f=f0+feq exp(-kobs t) 拟合，kobs 随受体浓度 crec 线性增加，kobs=ka crec+kd，从而获得 ka、kd 和 KD。由于膜囊泡构象变化或表面捕获的膜碎片脱落，频率可能出现回升；缓冲液洗去后粘度下降，紧密结合复合物缓慢解离，1% SDS 可再生表面。信号大小与可及受体浓度相关，但无外源信号放大。
检测灵敏度
slope = 0.00574 ± 0.00075 nmol^-1 L s^-1；R = 0.983, n = 4
效应效果
该传感器可重复使用，1% SDS 再生后恢复基线。加入 1 μM 游离 cryptogein 可在 2 min 内完全释放结合膜囊泡，表明结合特异。荧光定量显示新鲜质膜囊泡可及受体位点为 136 pmol/mg 总膜蛋白，RSO 取向 >90%；冻融后转为 RSI 而不可用。与放射性标记法文献 KD=2 nM 相比，本文 KD=12.0 nM 偏高，但 ka 高于文献 1.35×10^5 M^-1 s^-1。L19R 突变体 kobs=0.45±0.17×10^-3 s^-1，较野生型 7.92±0.40×10^-3 s^-1 慢约 18 倍，说明第 19 位对受体结合和固醇结合关键。QCM 压电传感器适合保持膜受体天然状态并实时研究膜囊泡-配体相互作用。
传感器的构成
- 换能器基底：10 MHz 压电石英晶体谐振器（QCM），光学抛光表面，5 mm 金电极，提供压电频率响应。
- 自组装修饰层：半胱胺（cysteamine）20 mg/mL 水溶液形成自组装单分子层（SAM），在金表面提供氨基。
- 交联活化层：戊二醛（glutaraldehyde）4% 水溶液活化氨基，用于与 cryptogein 氨基形成席夫碱。
- 识别元件：野生型或突变型 cryptogein（500 μg/mL）共价固定于表面，作为配体捕获膜受体。
- 还原稳定层：硼氢化钠（NaBH4）5 mg/mL 还原席夫碱，提高表面固定稳定性。
- 流通检测池：薄层流通池（10 μL）与蠕动泵（40 μL/min），实现流式进样、洗涤和再生。
- 再生清洗试剂：1% SDS 破坏亲和复合并洗脱膜碎片，恢复传感表面基线。
- 信号读出模块：Lever Oscillator 驱动晶体，UZ 2400 计数器与 LabTools 软件采集频率数据。
中文摘要
Elicitins 是卵菌 Phytophthora 分泌的低分子量蛋白，可诱导烟草超敏反应，其起始步骤被认为是与质膜高亲和位点结合。本研究采用压电生物传感器，在流通模式下实时研究 cryptogein 与烟草质膜结合位点的相互作用。野生型和突变型 cryptogein 通过氨基共价固定于压电石英晶体传感表面，含受体的烟草质膜囊泡作为溶液相分析物。通过不同受体浓度下的结合曲线拟合，获得表观结合速率常数 kobs，并进一步计算结合速率常数 ka=5.74×10^6 M^-1 s^-1、解离速率常数 kd=6.87×10^-4 s^-1 和平衡解离常数 KD=12.0 nM。结果表明，压电生物传感器能够保持膜囊泡中受体的天然状态和正确取向，适合用于膜受体-配体相互作用的实时动力学分析。
英文摘要
Elicitins are low-molecular-weight proteins representing the elicitor family secreted by many species of the oomycete Phytophthora. Elicitins induce a hypersensitive reaction in tobacco, a process that is triggered by binding of elicitin to the high-affinity site on the plasma membrane. Specific interaction of cryptogein with the binding sites on tobacco plasma membranes was studied using the piezoelectric biosensor in real time in a flow-through mode. Cryptogeins (wild-type and mutant forms) were covalently immobilized on the sensing surface, and membrane vesicles containing receptors were in solution. Kinetic characterization of the interaction provided values of kinetic rate association (k(a))=5.74 . 10(6)M(1)s(-1) and kinetic rate dissociation (k(d))=6.8710(-4)s(-1) constants, respectively. The kinetic equilibrium dissociation constant was calculated as K(D)=12.0 nM. The piezoelectric biosensor appeared to be a convenient tool for studying interactions of receptors embedded in membrane vesicles.