组成图示
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传感器类型
全细胞生物传感器
检测对象
人巨细胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV）；样品基质：体外培养细胞（SE/15细胞培养物）、HEL培养的临床分离株HCMV（细胞相关病毒或细胞裂解液）
检测原理
SE/15细胞稳定表达GFP-PML，未感染时GFP-PML以核内点状核体存在。HCMV进入细胞后，其基因组邻近PML体并启动即刻早期基因IE1表达；IE1促使PML去SUMO化，使GFP-PML核体由点状变为核内弥散。该形态变化作为识别事件，将病毒存在转换为GFP荧光分布变化。定量时可采用两条读出路径：成像法用荧光显微镜采集GFP图像，经ImageJ阈值和粒子分析区分小GFP-PML点与弥散核，感染率等于弥散核数除以总核数；NPB法利用感染核中弥散PML可溶于NP-40，用NPB缓冲液提取后在荧光酶标仪测量GFP荧光，净荧光与总裂解荧光之比反映感染细胞比例。信号随感染细胞数或病毒滴度增加而增强。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该方法无需固定和免疫染色，可在感染后3–4 h观察到GFP-PML弥散，10–16 h信号增加，适合实时监测。NPB荧光法只需提取和板读两步，快速、简单，适合高滴度实验室株（Towne、AD169）和抑制试剂筛选；GFP-PML成像法灵敏度高，可在微型培养中直接计数感染核，适用于低滴度、细胞相关临床分离株。肝素进入抑制试验给出IC50为9.43 μg/mL。药敏试验中，更昔洛韦（GCV）终浓度0.1–100 μM、膦甲酸钠（FOS）1–1,000 μM，通过剂量-反应曲线计算IC50。数据通常取3–5个视野均值。作者主张其可用于HCMV滴度测定、抗病毒药物筛选和临床分离株药敏评价。
传感器的构成
- 基底/培养载体：组织培养板或玻璃底荧光黑色96孔板（Greiner #655896），涂覆人纤连蛋白（fibronectin, 10 μg/mL），用于SE/15细胞贴附、培养与荧光成像。
- 传感细胞层：SE/15细胞（CHO来源，稳定表达GFP-PML并过表达人p180），作为识别HCMV感染并产生荧光报告的活细胞传感器。
- 识别元件：细胞核内GFP-PML核体（PML bodies/ND10），HCMV IE1表达后发生去SUMO化和弥散，作为感染识别事件。
- 信号标记物：绿色荧光蛋白（GFP）融合于PML，感染后核内GFP由点状变为弥散，提供可直接读出的荧光信号。
- 裂解/提取介质：NPB缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、0.15% NP-40、150 mM NaCl、15 mM MgCl2、5 mM EDTA），溶解感染核中弥散PML并释放GFP荧光。
- 读出系统：荧光显微镜（Olympus IX71）配冷却CCD相机（Olympus DP50）或荧光酶标仪（CytoFluor 4000，激发485 nm/发射510 nm），配合ImageJ进行定量。
- 辅助细胞：HEL人二倍体成纤维细胞，用于培养HCMV临床分离株并与SE/15共培养，支持病毒复制和转移。
- 药敏试剂：更昔洛韦（GCV）、膦甲酸钠（FOS）和肝素（heparin），用于抗病毒药物敏感性试验和病毒进入抑制试验。
中文摘要
人巨细胞病毒（HCMV）感染会显著改变早幼粒细胞白血病（PML）核体的形态。本文报道了一种用于体外实时监测HCMV感染细胞的新方法：建立稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）-PML融合蛋白的细胞系SE/15。未感染时，SE/15细胞核内存在点状GFP-PML核体；HCMV感染后，病毒即刻早期基因IE1表达导致PML去SUMO化，GFP-PML核体发生特异性弥散，使感染细胞无需固定和免疫染色即可通过荧光显微镜直接观察。作者进一步建立了两种定量方案：NPB荧光检测法和GFP-PML成像分析法。NPB法利用感染核中弥散PML可溶于NP-40缓冲液的特点，通过提取后测量GFP荧光强度快速、敏感地定量感染细胞，适合筛选抑制试剂；成像法通过荧光显微图像和ImageJ粒子分析直接计数弥散核，灵敏度高，适用于低滴度临床分离株的病毒滴度测定和药物敏感性试验。
英文摘要
Human cytomegalovirus (HCMV) infection has a marked effect on promyelocytic leukemia (PML) bodies. Here, we describe a novel real-time monitoring system for HCMV-infected cells in vitro using a newly established cell line that stably expresses GFP-PML protein. Upon infection, HCMV causes specific dispersion of GFP-PML bodies, thereby allowing the infected cells to be monitored by fluorescence microscopy without immunostaining. Quantitative protocols using either an NPB fluorescence assay or a GFP-PML imaging assay are also described. The NPB fluorescence assay is rapid, sensitive, and sufficiently simple for screening of inhibitory reagents, while the GFP-PML imaging assay is highly sensitive and applicable to drug susceptibility testing of low-titer clinical isolates.