组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
肉毒神经毒素A（botulinum neurotoxin serotype A, BoNT/A）及其重链结合域片段模拟物（BoNT/A-HC-fragment）；样品基质：缓冲液、胎牛血清（FBS）
检测原理
该传感器采用可再生表面荧光夹心免疫分析。AR4单克隆抗体共价偶联于NHS活化琼脂糖微珠，被旋转杆流动池捕获形成微柱；样品中的BoNT/A或其重链结合域片段被AR4特异性捕获，随后用SuperBlock T20 PBS洗涤去除基质。Alexa Fluor 647标记的RAZ1抗体与毒素另一表位结合，形成固相荧光夹心复合物。快速洗涤去除游离荧光抗体后，633 nm HeNe激光经光纤激发Alexa 647，发射光经90°光纤、长通和带通滤光片进入PMT。快洗阶段积分荧光信号随毒素浓度增加而升高，因为更多夹心复合物保留在微珠上。系统无酶催化放大，主要依赖高亲和抗体、多孔琼脂糖微珠保留和光学背景抑制；每次测量后释放旧珠并更换新珠，实现表面可再生。
检测灵敏度
LOD: 10 pM；对应浓度: 0.5 ng/mL（50 kDa片段）或1.5 ng/mL（150 kDa全毒素）；样品量: 100 μL时检出50 pg片段；校准范围: 0–250 pM
效应效果
控制实验显示，使用非特异性Alexa 647标记抗体时，信号不随抗原浓度变化，表明信号来自特异性夹心复合物。FBS基质中样品灌注可产生本底荧光或散射，但洗涤后回落。10 pM处背景扣除信号RSD为42%（750–850 s积分）或19%（750–1100 s积分）；空白标准差约为10 pM信号标准差的一半，10 pM平均信号为空白标准差的4.4倍（短积分）或超过10倍（长积分）。快速筛查每样品<20 min。相比小鼠生物测定需数天、ELISA需3–8 h及光纤倏逝波免疫传感器30 pM/20 min，本方法在20 min内达10 pM，并具自动流体控制和可再生表面优势。
传感器的构成
- 流动池基底/换能器：CTFE（氯三氟乙烯）旋转杆流动池，内置约1.04 mm柱流道和45°斜切镍杆，用于捕获琼脂糖微珠并形成可再生微柱。
- 固相载体：NHS-activated Sepharose 4B Fast Flow 琼脂糖微珠（75–150 μm），作为可再生固相载体，提供多孔水凝胶介质并减少光散射。
- 捕获识别元件：AR4单克隆抗体（IgG），共价偶联于NHS活化琼脂糖微珠表面，特异性捕获BoNT/A或其重链结合域片段。
- 封闭/洗涤介质：Tris缓冲盐（TBS, pH 8.0）用于封闭剩余NHS位点；SuperBlock T20 (PBS) Blocking Buffer作为载液和洗涤液，降低非特异结合。
- 报告识别/信号标记：Alexa Fluor 647标记的RAZ1单克隆抗体（IgG），与AR4识别不同表位，形成荧光夹心复合物。
- 光学激发/收集：HeNe激光（633 nm）经633 nm激光线滤光片由一根低OH光纤导入流动池；另一根光纤以90°收集发射光。
- 信号读出：647 nm RazorEdge长通滤光片、675 nm带通滤光片和Hamamatsu PMT（H6779-20）将荧光转换为电信号。
- 流体控制：顺序注射系统（SI），包括Cavro XP3000注射泵、10-port Cheminert阀和FEP管路，用于自动进样、洗涤和换柱。
中文摘要
本文报道了一种用于快速检测A型肉毒神经毒素的可再生表面生物传感器。该传感器基于流动注射自动化荧光夹心免疫分析，并采用毒素重链约50 kDa重组蛋白片段作为结构有效模拟物。单克隆抗体AR4和RAZ1分别结合完整肉毒毒素（约150 kDa）上两个不重叠表位，且这两个表位均位于重组片段上。AR4抗体共价偶联于琼脂糖微珠，用作捕获抗体；顺序注射流动系统输送微珠悬浮液，在旋转杆流动池中捕获形成3.6 mL微柱。样品灌注并洗去基质后，用Alexa 647标记的RAZ1抗体作为报告抗体灌注微柱。与旋转杆流动池成90°耦合的两根光纤分别导入633 nm HeNe激光激发光和收集荧光发射光。每次测量后，使用过的琼脂糖微珠被释放并更换新珠。在快速筛查模式下，该系统可在20分钟内将毒素模拟物检测至10 pM。
英文摘要
A renewable surface biosensor for rapid detection of botulinum neurotoxin serotype A is described based on fluidic automation of a fluorescence sandwich immunoassay, using a recombinant protein fragment of the toxin heavy chain ( approximately 50 kDa) as a structurally valid simulant. Monoclonal antibodies AR4 and RAZ1 bind to separate non-overlapping epitopes of the full botulinum holotoxin ( approximately 150 kDa). Both of the targeted epitopes are located on the recombinant fragment. The AR4 antibody was covalently bound to Sepharose beads and used as the capture antibody. A rotating rod flow cell was used to capture these beads delivered as a suspension by a sequential injection flow system, creating a 3.6 microL column. After perfusing the bead column with sample and washing away the matrix, the column was perfused with Alexa 647 dye-labeled RAZ1 antibody as the reporter. Optical fibers coupled to the rotating rod flow cell at a 90 degrees angle to one another delivered excitation light from a HeNe laser (633 nm) using one fiber and collected fluorescent emission light for detection with the other. After each measurement, the used Sepharose beads are released and replaced with fresh beads. In a rapid screening approach to sample analysis, the toxin simulant was detected to concentrations of 10 pM in less than 20 minutes using this system.