组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
Ca2+/钙调蛋白复合物（Ca2+/calmodulin, Ca2+/CaM）、MLCK 活性；样品基质：完整小鼠肠系膜动脉平滑肌细胞/组织
检测原理
KCl 或 α1 肾上腺素能激动剂 PE 使动脉平滑肌去极化或激活 GPCR，细胞内 Ca2+ 升高并与钙调蛋白形成 Ca2+/CaM。Ca2+/CaM 结合外源 MLCK 生物传感器的 Ca2+/CaM 结合域，引起传感器构象变化，改变 CFP 与 YFP 之间的荧光共振能量转移效率。显微镜分别采集 CFP（480/40 nm）和 YFP（535/35 nm）发射，计算 FRET 比值；FRET 比值随 Ca2+/CaM 结合增加而升高，反映 MLCK 激活。PKA 或 CaMKII 磷酸化 MLCK Ser1760 可降低其对 Ca2+/CaM 的亲和力，使 FRET 比值下降。该传感器无酶促或核酸放大，直接以构象相关 FRET 作为信号。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
转基因小鼠血压、心率及动脉对 KCl/PE 收缩与野生型无显著差异，外源 MLCK 约为内源 30%（0.32±0.03）。KCl 下 fura-2 与 MLCK FRET 时间过程相似，张力则相性峰值后维持。Y-27632 显著降低张力性张力（P<0.001，n=13），对 Ca2+/FRET 影响较小（P<0.05，n=7）；Gö6976 无显著作用（P>0.05，n=3–6）；KN-93 降低张力、Ca2+ 和 FRET（P<0.01/0.05，n=3–5）。相同张力下 PE 的 FRET 为 KCl 的 62%（P<0.01，n=6）。forskolin 在 KCl 下使 FRET 和张力快速下降约 50% 而不改变 Ca2+。作者认为该传感器可实时监测完整动脉 MLCK 激活与钙敏感性。
传感器的构成
- 细胞基底：转基因小鼠肠系膜动脉平滑肌细胞（TG mouse mesenteric artery smooth muscle cells），表达外源 MLCK 生物传感器
- 外源蛋白表达层：外源 MLCK 生物传感器（exogenous MLCK biosensor），约相当于内源 MLCK 的 30%
- 识别元件：Ca2+/CaM 结合域（Ca2+/CaM-binding domain），识别 Ca2+/钙调蛋白复合物
- 信号换能元件：CFP-YFP FRET 对（CFP/YFP），构象变化改变 FRET 效率
- 荧光读出层：CFP 发射滤片 480/40 nm 与 YFP 发射滤片 535/35 nm，配合增强 CCD 相机采集
- 辅助钙指示剂：fura-2 AM 或 fluo-4 AM，用于同步或分别监测细胞内 Ca2+
- 力学读出装置：confocal wire myograph，记录动脉张力
中文摘要
本研究利用表达外源肌球蛋白轻链激酶（MLCK）荧光共振能量转移（FRET）活性生物传感器的转基因小鼠，研究完整肠系膜动脉中 Ca2+/钙调蛋白（Ca2+/CaM）对 MLCK 的激活与调节。高外钾使细胞内 Ca2+（fura-2 比值或 fluo-4 荧光）和 MLCK FRET 比值均快速升至峰值后先快后慢下降；张力先出现相性峰值，随后维持或缓慢上升为张力性收缩。Rho 激酶抑制剂 Y-27632 主要降低张力性张力，对 Ca2+ 和 MLCK 激活影响较小；PKCα/β 抑制剂 Gö6976 无显著作用；CaMKII 抑制剂 KN-93 明显降低张力、FRET 和 Ca2+。在张力性收缩期加入 forskolin 使 MLCK FRET 和张力快速下降而 Ca2+ 不变，提示 cAMP/PKA 降低 MLCK 对 Ca2+/CaM 的亲和力；但 β 肾上腺素能受体介导的 cAMP 升高不能引起类似舒张。相同张力下，α1 肾上腺素能激动剂酚肾上腺素引起的 MLCK FRET 约为 KCl 的 60%。结果表明，KCl 诱导的动脉平滑肌 MLCK 活性主要由 Ca2+/CaM 决定，Rho 激酶通过未知机制显著增加钙敏感性，药理 cAMP 而非受体 cAMP 可快速降低 MLCK 对 Ca2+/CaM 的亲和力。
英文摘要
Activation of myosin light chain kinase (MLCK) and other kinases was studied in the arteries of transgenic mice that express an optical fluorescence resonance energy transfer (FRET) MLCK activity biosensor. Binding of Ca(2+)/calmodulin (Ca(2+)/CaM) induces an increase in MLCK activity and a change in FRET. After exposure to high external [K(+)], intracellular [Ca(2+)] (fura-2 ratio or fluo-4 fluorescence) and MLCK activity both increased rapidly to an initial peak and then declined, rapidly at first and then very slowly. After an initial peak ('phasic') force was constant or increased slowly (termed 'tonic' force). Inhibition of rho-kinase (Y-27632) decreased tonic force more than phasic, but had little effect on [Ca(2+)] and MLCK activation. Inhibition of PKCalpha and PKCbeta with Gö6976 had no effect. KN-93, an inhibitor of CaMK II, markedly reduced force, MLCK FRET and [Ca(2+)]. Applied during tonic force, forskolin caused a rapid decrease in MLCK FRET ratio and force, but no change in Ca(2+), suggesting a cAMP mediated decrease in affinity of MLCK for Ca(2+)/CaM. However, receptor (beta-adrenergic) activated increases in cAMP during KCl were ineffective in causing relaxation, changes in [Ca(2+)], or MLCK FRET. At the same tonic force, MLCK FRET ratio activated by alpha(1)-adrenoceptors was approximately 60% of that activated by KCl. In conclusion, MLCK activity of arterial smooth muscle during KCl-induced contraction is determined primarily by Ca(2+)/CaM. Rho-kinase is activated, by unknown mechanisms, and increases 'Ca(2+) sensitivity' significantly. Forskolin mediated increases in cAMP, but not receptor mediated increases in cAMP cause a rapid decrease in the affinity of MLCK for Ca(2+)/CaM.