组成图示
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传感器类型
其他（遗传编码BRET生物传感器）
检测对象
低氧（hypoxia）/缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）；样品基质：HEK 293 细胞/细胞裂解液、SCID 小鼠皮下异种移植瘤（体内组织）
检测原理
低氧或肿瘤微环境中 HIF-1α 稳定并上调，作为识别事件结合 E-M-H 嵌合增强子（EBS、MRE、HRE），激活 SV40 最小启动子，驱动 mCherry–firefly luciferase 融合蛋白转录翻译。融合蛋白中萤火虫荧光素酶催化 d-luciferin 氧化，产生约 575 nm 生物发光；由于 mCherry 激发波长约 585 nm 与供体发射光谱重叠，生物发光能量通过 BRET 非辐射转移至 mCherry，使其发射红色/近红外荧光，无需外部激发。HIF-1α 水平越高，融合蛋白表达量越大，底物催化和 BRET 荧光越强，因此荧光/生物发光信号随低氧程度或 HIF-1α 活性呈比例增加。信号放大主要依赖遗传转录放大和 BRET 能量转移。
检测灵敏度
未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或R^2。
效应效果
体外实验中，E-M-H-mCherry-Luc 与不同量 pcDNA3-HIF-1α 共转染 HEK 293 细胞（荧光实验 0.01–0.32 μg；荧光素酶实验 0.02–0.64 μg），mCherry 荧光和荧光素酶活性随 HIF-1α 量增加而增强；空载体对照呈类似比例响应，但最大荧光素酶活性显著更高。体内实验中，激活组（E-M-H-mCherry-Luc 加 0.5 μg pcDNA3-HIF-1α）皮下接种 SCID 小鼠后，荧光和生物发光均显著高于未激活组；注射 d-luciferin 后 BRET 峰在 15 min 出现。作者认为该传感器可克服组织自荧光和外部激发穿透限制，用于肿瘤低氧与新生血管功能成像。
传感器的构成
- 遗传调控层：E-M-H 嵌合增强子（含 EBS、MRE、HRE）与 SV40 最小启动子，响应 HIF-1α 并驱动下游报告基因转录
- 识别元件：HIF-1α 转录因子，低氧/肿瘤新生血管相关，结合 E-M-H 增强子启动表达
- 荧光报告层：mCherry 荧光蛋白，作为 BRET 受体，发射红色/近红外荧光
- 生物发光供体层：firefly luciferase（萤火虫荧光素酶），催化底物产生 575 nm 生物发光并作为 BRET 供体
- 底物/电子供体：d-luciferin（D-荧光素），体内注射后支持荧光素酶发光反应
- 表达/样品基质：HEK 293 细胞或 SCID 小鼠皮下异种移植瘤，承载遗传编码传感器并产生信号
- 信号读出层：IVIS Spectrum 活体成像系统、Lumat LB 9507 光度计、Leica TCS-SP2 共聚焦显微镜，记录荧光/生物发光/BRET 信号
中文摘要
光学成像方法，尤其是荧光成像，因荧光蛋白的广泛应用而成为监测癌症等生物过程的重要手段。然而，绿色荧光蛋白（GFP）等常用探针在活体中易受内源性荧光团吸收激发光引起的自荧光和信号弥散影响，限制其作为体内示踪剂的适用性。近年来，近红外荧光蛋白的发展使实时成像可避免自荧光干扰并实现更深层组织观察。为此，作者设计了一种由新生血管相关转录因子缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）激活的荧光–生物发光遗传编码生物传感器。该传感器包含可响应 HIF-1α 的调控模块和由 mCherry 荧光蛋白与萤火虫荧光素酶组成的双报告融合蛋白。由于两者光谱重叠，融合蛋白可发生生物发光共振能量转移（BRET），使荧光蛋白无需外部激发即可被生物发光激发，从而形成一类用于低氧功能成像的新型遗传编码生物传感器。
英文摘要
Optical imaging methods, such as fluorescence, have greatly increased its impact as a monitoring technique with the development of a broad range of fluorescent proteins used to visualize many types of biological processes, such as cancer biology. Although the most popular of these proteins is the green fluorescent protein (GFP), autofluorescence due to the absorption of the exciting radiation by endogenous fluorophores and signal dispersion raises doubts about its suitability as an in vivo tracer. In the last years a number of groups have developed several NIR fluorescent proteins that enables real-time imaging to take place without interference from autofluorescence events allowing at the same time to take a deep view into the tissues. We therefore have outlined fluorescence-bioluminescence genetically encoded biosensor activated by the neoangiogenesis-related transcription factor HIF-1alpha, which is upregulated in growing tumors. At the same time, by fusing a fluorescent to a bioluminescent protein, we obtained a bioluminescence resonance energy transfer (BRET) phenomenon turning this fusion protein into a new class of hypoxia-sensing genetically encoded biosensor.