组成图示
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传感器类型
综述或非传感器论文
检测对象
未报道明确检测对象；仅表征生物素（biotin）与生物素化CPFB标签蛋白（biotinylated SAK-CPFB），样品基质为低盐磷酸盐缓冲液（10 mM磷酸钠/NaCl，pH 6.8）
检测原理
该系统以工程单链链霉亲和素M6为识别/固定元件。M6保留可逆生物素结合能力，与生物素结合时产生界面质量变化，可用BIAcore SPR实时监测；其结合速率ka=(1.83±0.03)×10^4 M^-1 s^-1，解离速率kd=(3.41±0.07)×10^-3 s^-1，Kd=(1.86±0.01)×10^-7 M。当生物素化CPFB标签蛋白进入体系时，标签中的生物素先被M6捕获，使标签在M6表面受限并绕生物素化赖氨酸旋转；随后CPFB中的半胱氨酸与M6 C118形成分子间二硫键，将瞬时亲和结合转化为共价固定。若用于传感，结合/共价复合物形成会改变SPR响应或界面质量，而加入还原剂和过量生物素可断裂二硫键并置换生物素，使信号下降并实现芯片再生。
检测灵敏度
未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
M6与生物素动力学经三次独立实验测定，平均ka=(1.83±0.03)×10^4 M^-1 s^-1、kd=(3.41±0.07)×10^-3 s^-1、Kd=(1.86±0.01)×10^-7 M，与M4相近，说明新增突变未显著改变结合。共价异二聚体形成依赖生物素化，未生物素化SAK-CPFB不形成复合物；SAK-CPFB/M6摩尔比≥2时复合物信号达平台，比例1时同二聚体竞争导致效率下降。低盐缓冲液（10 mM NaCl）降低M6聚集并提高活性。CPFB标签半胱氨酸位置灵活，±2等位置可形成二硫键，-12效率较低。作者认为该系统兼具固定与可逆再生能力，可用于可重复使用生物传感器/蛋白芯片、生物反应器、受体定量和亲和纯化。
传感器的构成
- 识别/固定元件：工程单链链霉亲和素M6（T76R、V125R、V55T、L109T、N118C、W120S），提供可逆生物素结合口袋和C118用于二硫键形成
- 配体/标签：含半胱氨酸生物素化肽标签CPFB（如SAK-CPFB(±2)），经BirA生物素化，提供生物素捕获位点和半胱氨酸
- 捕获配体：生物素（biotin），与M6生物素结合位点结合，介导初始捕获
- 共价连接：M6 C118与CPFB半胱氨酸形成分子间二硫键，将瞬时结合转化为稳定固定
- 解离试剂：还原剂（β-巯基乙醇ME或TCEP）和过量生物素，用于断裂二硫键并置换生物素实现再生
- 表征平台：BIAcore CM5芯片与BIAcore X SPR仪，用于实时监测M6-生物素结合动力学
- 质量鉴定：SELDI-TOF-MS ProteinChip NP20，用于鉴定M6/SAK-CPFB共价复合物分子量
中文摘要
天然四聚体链霉亲和素以超紧结合（Kd 10^-13至10^-14 M）捕获并固定生物素化分子，而工程化单链链霉亲和素仅具有可逆结合（Kd 10^-7 M）。为获得兼具天然链霉亲和素固定能力和单链链霉亲和素可逆反应性的理想工程链霉亲和素，作者通过分子建模设计了一对工程生物材料：工程单链链霉亲和素M6，其生物素结合位点附近引入半胱氨酸C118；以及含半胱氨酸的生物素化标签。M6与生物素化肽标签的相互作用经历捕获和固定两个阶段，生成共价连接复合物。生物素化对捕获阶段必不可少。一旦标签中的生物素被M6捕获，标签可折叠并绕生物素化赖氨酸为轴在复合物表面旋转，直至形成二硫键。因此，标签中不同位置邻近生物素的半胱氨酸均可与M6形成二硫键。M6与含标签蛋白之间的分子间二硫键赋予M6固定能力。在还原剂和生物素存在下，结合配体可解离。该系统有望扩展生物素-链霉亲和素技术，用于开发可重复使用生物传感器/蛋白芯片和生物反应器。
英文摘要
Natural tetrameric streptavidin captures and immobilizes biotinylated molecules with ultra-tight binding (K(d) approximately 10(-13) to 10(-14) M). In contrast, engineered monomeric streptavidin offers reversible binding (K(d) approximately 10(-7) M). To develop an ideal engineered streptavidin which possesses both the immobilization capability of the natural streptavidin and the reversible interaction reactivity of the monomeric streptavidin, a pair of engineered biomaterials was designed through molecular modeling. This system consists of two recombinant components: an engineered monomeric streptavidin M6, which has a cysteine residue (C118) near the biotin binding site, and a cysteine containing biotinylation tag. Interactions between M6 and the biotinylated peptide tag go through a two-stage process (capture and immobilization) to generate a covalently linked complex. Biotinylation is essential in the capture stage. Once the biotin moiety in the biotinylated tag is captured by M6, the biotinylated tag can fold back and rotate on the surface of the complex with the biotinylated lysine in the peptide tag as the axis until the formationof a disulfide bond. Consequently, cysteine residue in different positions flanking the biotin residue in the biotinylation tag can successfully form a disulfide bond with M6. Intermolecular disulfide bond formation between M6 and the tag containing protein offers the immobilization capability to M6. In the presence of reducing agent and biotin, bound ligands can be dissociated. This system has the potential to extend the biotin-streptavidin technology to develop reusable biosensor/protein chips and bioreactors.