组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
雌三醇-16-葡萄糖醛酸（estriol-16-glucuronide, E3-16G）；样品基质：水样/液相样品（文中提及尿液、废水、饮用水等潜在基质）
检测原理
该传感器采用竞争性抑制免疫SPR原理。E3-16G经OEG连接臂偶联OVA后，通过EDC/NHS胺基偶联固定于CM5芯片表面，形成固定抗原层。样品中游离E3-16G与抗E3-16G多克隆一抗（pAb）或pAb-Au偶联物预先孵育，随后注入芯片。游离E3-16G浓度越高，占据抗体结合位点越多，能与芯片固定E3-16G结合的pAb/pAb-Au越少，SPR响应越低；反之响应升高。15 nm金胶体直接偶联一抗，作为高分子量标记物靠近芯片表面，显著增强局部质量变化引起的SPR信号。BIAcore X100实时监测响应单位（RU），参考流路OVA扣除背景，经四参数逻辑曲线定量。
检测灵敏度
LOD: 76 pg/mL（pAb体系）；LOD: 14 pg/mL（pAb-Au增强体系）；IC50: 0.211 ng/mL（非增强）/0.033 ng/mL（增强）；标准曲线范围: 0–300 ng/mL（pAb体系）
效应效果
方法无需水解、萃取或衍生化，7.5 min内完成水样定量。非增强pAb体系内标CV<3.90%（1 µg/mL）和4.35%（5 µg/mL），批间CV在LOD为12.29%和9.64%，IC50为0.84%和5.86%；pAb-Au增强体系内标CV<4.46%，批间CV在LOD为9.75%、IC50为7.3%。表面经1012次结合/再生循环后响应由129 RU降至123.6 RU。金纳米颗粒使LOD从76 pg/mL降至14 pg/mL，IC50降低6.38倍，比文献类似纳米颗粒增强一抗体系灵敏约10倍，且比RIA、HPLC、LC/MS更快速。可用于月经周期、胎儿健康、高危妊娠及废水/饮用水监测。
传感器的构成
- 基底/换能器：BIAcore CM5 羧甲基葡聚糖（CM5）SPR 芯片，提供 SPR 换能与羧基固定位点
- 活化层：EDC/NHS 混合液，活化 CM5 羧基形成 NHS 酯
- 固定抗原层：E3-16G-OEG-OVA 蛋白偶联物，经胺基偶联固定，提供 E3-16G 表位；OEG 连接臂降低空间位阻和非特异结合
- 参考层：OVA 偶联于参考流路 FC1，用于扣除非特异结合
- 识别元件：抗 E3-16G 多克隆一抗（pAb，文中亦称兔抗绵羊一抗），与游离 E3-16G 或芯片 E3-16G 竞争结合
- 信号标记物：15 nm 金胶体（Au NPs）直接偶联 pAb，作为高分子量 SPR 信号放大标记
- 封闭/再生介质：BSA 封闭 Au NPs 未反应位点；乙醇胺淬灭芯片活化位点；HBS-EP 运行缓冲液；NaOH/乙腈再生
中文摘要
为定量检测液相中低水平雌三醇代谢物雌三醇-16-葡萄糖醛酸（E3-16G），作者开发了一种基于表面等离子共振（SPR）的简单高灵敏免疫传感方法，无需水解、萃取或衍生化等耗时样品前处理。E3-16G经寡乙二醇（OEG）连接臂偶联至卵白蛋白（OVA），形成E3-16G-OEG-OVA蛋白偶联物，并通过胺基偶联固定于羧甲基葡聚糖（CM5）SPR传感芯片表面，建立竞争性抑制免疫分析体系。以兔抗绵羊一抗为结合抗体时，检出限（LOD）达76 pg/mL；进一步将合成15 nm金胶体作为高分子量标记物直接偶联至一抗，形成pAb-Au纳米颗粒增强体系，可将水样中E3-16G在7.5 min内定量至14 pg/mL。E3-16G-OEG-OVA传感表面稳定性高，经1000次以上结合/再生循环后抗体结合能力无明显下降，显著降低使用成本。
英文摘要
For the quantitative evaluation of low levels of an estriol metabolite of estriol (estriol-16-glucuronide (E3-16G)) in liquid media, we developed a simple and highly sensitive immunoassay using a surface plasmon resonance (SPR) biosensor which did not require any time-consuming sample pretreatment steps. E3-16G was conjugated to ovalbumin (OVA) through an oligoethylene glycol (OEG) linker to form protein conjugates (E3-16G-OEG-OVA), which were then immobilized on a carboxymethyl dextran-coated sensor chip via amine coupling to develop inhibition immunoassays. A limit of detection (LOD) of 76 pg/mL was achieved using a rabbit anti-sheep primary antibody as a binding agent. The detection limit was further improved by using synthesized gold colloids (15 nm) as high mass labels conjugated to the primary antibody. In this Au nanoparticle-enhanced assay, the concentration of E3-16G in aqueous samples could be determined in 7.5 min at a level as low as 14 pg/mL. In addition, the high stability of the E3-16G-OEG-OVA surface gave no obvious drop in antibody-binding capability after more than 1000 binding/regeneration cycles which significantly lowered the research cost.