组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
磺酰胺类碳酸酐酶II抑制剂（sulfonamide CAII inhibitors，如ethoxzolamide, ET）、磷酸酪氨酸肽（phosphotyrosine peptides，如pYVPM肽5）；样品基质：HEPES缓冲液、大肠杆菌细胞裂解液
检测原理
Q-LDT试剂由亲和配体、DEAC荧光团、DABCYL淬灭剂和甲苯磺酸酯连接臂组成。试剂的配体部分先结合CAII或SH2蛋白的结合口袋，使DEAC靠近蛋白表面亲核氨基酸；随后发生邻近诱导的SN2型甲苯磺酸酯反应，DEAC共价转移至His位点，同时配体-DABCYL片段作为离去基团裂解，但仍非共价占据结合口袋。由于DABCYL与DEAC距离很近，发生双分子荧光淬灭（BFQR），初始荧光较低。加入被测物（磺酰胺抑制剂或磷酸酪氨酸肽）后，其与蛋白口袋竞争结合，将DABCYL-配体片段排出，DEAC与淬灭剂距离增大，荧光恢复并随被测物浓度呈饱和式增强。该过程无需酶催化或核酸放大，主要依靠亲和识别与竞争置换实现信号开启。
检测灵敏度
Kapp(ET, CAII传感器): 8.0 × 10^5 M^-1；Kapp(肽5, SH2传感器): 1.1 × 10^5 M^-1；磷酸肽检测浓度范围: 1–100 µM
效应效果
CAII传感器保留天然选择性：ET、NB、SA、BS的F/F0分别为5.0（75 µM）、1.9（0.5 mM）、3.6（3.5 mM）、4.4（5 mM），TS仅1.1（50 mM）。估算净亲和力ET 3.3×10^8 M^-1、NB 3.4×10^7 M^-1、SA 2.7×10^6 M^-1、BS 4.1×10^6 M^-1，接近天然CAII。SH2传感器对含pYZXM基序的肽5、8、9、10响应明显，肽5 F/F0为2.7（120 µM），非磷酸肽6仅1.2（200 µM），其他SH2配体11/12响应弱。传感器可在纯化蛋白和大肠杆菌细胞裂解液中直接构建，裂解液无需纯化即显示肽5诱导的饱和荧光增强。数据为三次独立实验均值±SD，未报告RSD、稳定性、回收率或方法对比；作者认为可用于药物筛选和磷酸化肽检测。
传感器的构成
- 蛋白识别框架：人碳酸酐酶II（CAII）或p85 N端Src同源2域（p85-nSH2），提供特异性结合口袋与传感换能框架。
- 亲和导向标记试剂：淬灭配体导向甲苯磺酸酯（Q-LDT）试剂2/4，含亲和配体、DEAC荧光团、DABCYL淬灭剂和甲苯磺酸酯连接臂，介导一步位点标记。
- 荧光标记物：7-二乙氨基香豆素（DEAC），经SN2型甲苯磺酸酯反应共价连接至蛋白表面组氨酸（CAII His3或SH2 His407），作为荧光发射体。
- 淬灭标记物：4-二甲氨基偶氮苯-4-羧酸（DABCYL），与裂解配体共价连接，非共价占据结合口袋并通过双分子荧光淬灭（BFQR）压低初始荧光。
- 亲和配体/离去基团：苯磺酰胺（CAII）或磷酸肽pYVPM（SH2），引导Q-LDT试剂结合并在标记后仍非共价结合于口袋。
- 被测物竞争剂：磺酰胺类CAII抑制剂（如ethoxzolamide, ET）或磷酸酪氨酸肽（如肽5），竞争置换DABCYL-配体片段使荧光开启。
- 检测介质：50 mM HEPES缓冲液（pH 7.2/7.4/8.0）或大肠杆菌细胞裂解液，提供反应与荧光测量环境。
中文摘要
由蛋白框架与合成荧光团构成的半合成荧光生物传感器是特异性检测生物相关分子的重要分析工具。本文报道一种一步构建开式荧光半合成生物传感器的新方法。该策略基于配体导向甲苯磺酸酯（LDT）化学，这是一种亲和引导的蛋白标记方案，可位点特异性地将合成探针引入蛋白表面，同时释放亲和配体。作者设计了一类淬灭配体导向甲苯磺酸酯（Q-LDT）试剂，通过甲苯磺酸酯连接臂将有机染料与蛋白配体-荧光淬灭剂偶联物相连。Q-LDT介导的标记可一步将天然蛋白转化为荧光标记蛋白，且裂解产生的配体-淬灭剂片段仍非共价结合于蛋白结合口袋，使初始荧光被淬灭；当存在特异性分析物时，该片段被排出，荧光增强（开启）。该方法成功应用于碳酸酐酶II（CAII）和Src同源2（SH2）域，分别生成针对CAII抑制剂和磷酸酪氨酸肽的开式荧光生物传感器。详细研究表明所得传感器保留天然配体选择性，且LDT化学的高靶标特异性使其不仅可用于纯化蛋白，也可在大肠杆菌细胞裂解液中制备传感器，展示了Q-LDT方法拓展半合成生物传感器应用的潜力。
英文摘要
Semisynthetic fluorescent biosensors consisting of a protein framework and a synthetic fluorophore are powerful analytical tools for specific detection of biologically relevant molecules. We report herein a novel method that allows for the construction of turn-on fluorescent semisynthetic biosensors in a one-step manner. The strategy is based on the ligand-directed tosyl (LDT) chemistry, a new type of affinity-guided protein labeling scheme which can site-specifically introduce synthetic probes to the surface of proteins with concomitant release of the affinity ligands. Novel quenched ligand-directed tosylate (Q-LDT) reagents were designed by connecting an organic dye to a conjugate of a protein ligand and a fluorescence quencher through a tosyl linker. The Q-LDT-mediated labeling directly converts a natural protein to a fluorescently labeled protein that remains noncovalently complexed with the cleaved ligand-tethered quencher. The fluorescence of this labeled protein is initially quenched and only in the presence of specific analytes is the fluorescence enhanced (turned on) due to the expulsion of the ligand-quencher fragment. Using a single labeling step, this approach was successfully applied to carbonic anhydrase II (CAII) and a Src homology 2 (SH2) domain to generate turn-on fluorescent biosensors toward CAII inhibitors and phosphotyrosine peptides, respectively. Detailed investigations revealed that the obtained biosensors exhibit their natural ligand selectivity. The high target-specificity of the LDT chemistry also allowed us to prepare the SH2 domain-based biosensor not only in a purified form but also in a bacterial cell lysate. These results demonstrate the utility of the Q-LDT-based approach to expand the applications of semisynthetic biosensors.