组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin）；样品基质：牛肉背最长肌加热提取物（heated bovine Longissimus dorsi muscle extract），标准品为重组牛/人calpastatin
检测原理
金电极表面MUA SAM形成绝缘层，经EDC/NHS活化后通过PrA定向固定抗calpastatin抗体。当肉提取物中的calpastatin与抗体特异性结合时，在识别层外侧形成疏水蛋白层，使电极/溶液双电层向外移动，界面总电容下降。系统以50 mV、20 ms电位脉冲扰动工作电极界面，记录瞬态电流 i(t)=u/Rs exp(-t/RsCtotal)，由电流衰减提取总电容Ctotal；结合前后电容差ΔC及比表面电容ΔCs随calpastatin浓度增加而增大，实现无标记定量。低盐10 mM磷酸缓冲液降低背景电容和噪声。
检测灵敏度
线性范围: 20–160 ng/mL；线性回归因子: 0.9975；动态范围: 20–160 ng/mL；重组人calpastatin动态范围: 100–600 ng/mL
效应效果
传感器对提取缓冲液和100 ng/mL牛血清白蛋白（BSA）均无非特异信号；肉提取物稀释低于5倍时未观察到非特异响应，实际样品至少5倍稀释以消除干扰。电极经25 mM甘氨酸-HCl（pH 2.4）再生后可连续多次使用，绝缘层未受损；4°C存储7天灵敏度仅下降约8.5%，连续6 h不同浓度注射电容下降<10%。三个独立电极间变异接近20%，因此每个传感器使用前需校准。实际加热牛肉提取物中calpastatin测得482 ng/mL（N=3，CV=9.5%），ELISA测得428 ng/mL（N=3，CV=6.3%），结果良好相关。作者认为该传感器比ELISA、FRET和SPR等方法更简便、快速、灵敏，并易于微型化，适合牛肉嫩度快速分级。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：金电极（Au，Ø 3 mm金棒），作为工作电极和电容换能器
- 自组装单分子层：十一巯基癸酸（MUA）SAM，在Au表面形成绝缘层并提供羧基
- 化学活化层：EDC/NHS（1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基丁二酸酯）活化MUA羧基，用于共价偶联PrA
- 定向固定层：金黄色葡萄球菌蛋白A（Protein A, PrA），结合抗体Fc区，使抗体定向排列并便于再生
- 识别元件：抗calpastatin单克隆抗体（anti-calpastatin mAb，Fitzgerald），特异性识别calpastatin
- 封闭层：未使用额外封闭剂（长链MUA SAM已足够，原文测试后未采用）
- 运行介质：10 mM磷酸缓冲液（pH 7.4），作为流动注射载液和电容测量介质
- 再生液：25 mM甘氨酸-HCl（pH 2.4），用于解离抗原-抗体并再生电极
中文摘要
本研究开发并优化了一种无标记电容免疫传感器，用于检测肉类嫩度生物标志物钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin），并应用于牛肉提取物样品分析。传感器以金电极为基底，表面通过十一巯基癸酸（MUA）自组装单分子层（SAM）和金黄色葡萄球菌蛋白A（Protein A, PrA）定向固定抗calpastatin单克隆抗体。该免疫传感器作为工作电极置于流动注射系统的电化学检测池中，通过施加电位脉冲并记录界面电流响应，计算电极/溶液界面总电容变化，从而无标记地定量calpastatin。传感器对牛重组calpastatin的动态范围为20–160 ng/mL，电极经再生后可重复使用超过7天且灵敏度下降很小。实际样品取自屠宰后牛背最长肌，经加热提取后分别用该传感器和微孔板ELISA检测，结果良好相关。与传统方法相比，该传感器具有快速、简便、灵敏和易于微型化的优势，可用于牛肉嫩度快速分级。
英文摘要
An immunological capacitive biosensor for calpastatin was developed, optimized and applied for the analysis of meat extract samples. Anti-calpastatin antibody was immobilized on a gold electrode modified with a self-assembled monolayer of mercaptoundecanoic acid and Protein A from Staphylococcus aureus, and the obtained immunosensor was inserted as the working electrode in an electrochemical cell of a flow injection system. The dynamic range of the sensor was 20 to 160 ng/mL calpastatin. The electrode could be regenerated and re-used for more than 7 days with minimal reduction in sensitivity. For the analysis of real samples, the target analyte was extracted from the Longissimus dorsi muscle from beef carcasses directly after slaughtering. The extract was analyzed both with the developed immunosensor and microtiter plate ELISA, and a good correlation was obtained. However the immunosensor offers advantages of speed, simplicity, sensitivity and possibility for miniaturization over conventional assays for calpastatin quantification.