组成图示
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传感器类型
全细胞生物传感器
检测对象
毒蕈碱型乙酰胆碱受体激动剂（acetylcholine/ACh、carbachol、oxotremorine M、iperoxo、dualsteric hybrid 1）；样品基质：HBSS/HEPES缓冲液中的完整CHO细胞
检测原理
被测配体与CHO细胞膜上的hM2或hM5毒蕈碱型乙酰胆碱受体结合后，受体构象改变并激活相应G蛋白通路：偶数亚型hM2主要激活Gi/o，奇数亚型hM5主要激活Gq；部分正构激动剂还可激活Gs。受体激活引发胞内蛋白、囊泡或细胞器在膜附近发生重分布，改变RWG倏逝场（约150 nm）内的局部光学密度。RWG将光学密度变化转换为反射波长位移（pm），由Epic系统实时读出。百日咳毒素（PTX）可灭活Gi/o，forskolin可直接激活腺苷酸环化酶，从而区分不同通路方向。双立体激动剂hybrid 1仅保留Gi/o方向信号，不产生Gs方向DMR，体现通路选择性。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
hM2-CHO细胞中ACh诱导的DMR信号先快速上升后下降；hM5-CHO细胞中信号在45 min内较稳定。PTX（100 ng/mL）预处理消除hM2的Gi/o方向信号，并揭示反向Gs方向信号；forskolin在非转染CHO细胞中也可诱导类似反向DMR。双立体激动剂hybrid 1在最大活性浓度下不诱导Gs方向DMR。膜[35S]GTPγS实验显示，PTX预处理使受体介导结合降低约90%，ACh和iperoxo仍可刺激结合，而hybrid 1无效果，与atropine相当。数据以8次独立测定的均值±SEM表示，并在2–3次额外实验中重复。作者认为该方法可无标记、实时识别GPCR通路选择性药物。
传感器的构成
- 换能器基底：Corning Epic 384孔微孔板，每孔集成共振波导光栅（RWG）光学换能器，将细胞附近光学密度变化转换为反射波长位移
- 光学激励与读出：宽带激光光源和波长检测单元，激发RWG倏逝场并测量反射波长（pm）
- 识别元件：稳定表达人M2或M5毒蕈碱型乙酰胆碱受体（hM2/hM5）的CHO细胞，作为全细胞识别层
- 信号响应层：细胞内蛋白、囊泡或细胞器在受体激活后发生重分布，改变RWG可检测深度（约150 nm）内的局部光学密度
- 信号标记物：无外源标记（label-free），不依赖荧光、酶或放射性标记
中文摘要
在基础研究和药物发现中，通过G蛋白偶联受体（GPCR）实现通路选择性的胞内信号转导，已成为精确调控细胞功能的新策略。GPCR在信号转导上常具有多效性，即内源性递质或外源性药物刺激受体后可同时激活多条胞内生化通路。本研究考察了一类新型GPCR激活剂的信号行为，该类化合物被设计为同时结合毒蕈碱型乙酰胆碱受体的正构递质结合位点和别构位点。作者采用光学生物传感器技术，在稳定表达目标毒蕈碱受体亚型的CHO细胞中实时测量受体激活诱导的动态质量重分布（DMR）。通过信号通路调节工具以及直接测量G蛋白激活，证明DMR是一种有效且便捷的方法，可实时观察胞内信号通路激活，并用于识别具有信号通路选择性的药物。
英文摘要
Increasing attention is paid in basic science and in drug discovery to pathway selective intracellular signaling as a novel approach to achieve precise control of cell function via G protein-coupled receptors (GPCRs). With respect to signaling, GPCRs are often promiscuous in that more than one intracellular biochemical pathway is activated upon receptor stimulation by the endogenous transmitter or by exogenous drugs. We studied signaling by a novel class of GPCR activators that were designed to bind simultaneously to the orthosteric transmitter-binding site and the allosteric site of muscarinic acetylcholine receptors. An optical biosensor technique was applied to measure activation-induced dynamic mass redistribution (DMR) in CHO cells stably expressing the muscarinic receptor subtype of interest. The use of tools to modulate signaling and measuring G protein activation directly proved that DMR is a valid and comfortable approach to gain real-time insight into intracellular signaling pathway activation and to identify signaling pathway-selective drugs.