组成图示
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传感器类型
其他（纳米机械共振微悬臂梁生物传感器）
检测对象
组织蛋白酶B（Cathepsin B, CTSB）蛋白酶活性/浓度；样品基质：酸性磷酸盐缓冲液（PBS, pH 5, 10 mM）
检测原理
传感器以硅微悬臂梁为机械换能器，表面经APTES氨基化后固定PEG-GFLG肽链。当样品中的组织蛋白酶B（CTSB）进入酸性PBS时，其催化残基Cys25和His159特异性切割GFLG序列，使部分肽链从表面释放，悬臂梁总质量下降。干空气中，共振频率偏移与质量变化近似满足Δf/f0≈1/2·ΔM/Mc，因此质量减少导致基频升高，可定量计算被切割肽质量。液体中原位监测时，频率偏移还包含表面亲水性变化引起的水动力负载变化ΔMh；作者用干空气频率偏移确定切割质量，再用液体频率偏移和Mc+Mh估算实时切割质量。CTSB浓度越高，水解速率kp越大，液体频率偏移随时间按Langmuir模型Δf(t)=Δf0[1-exp(-kpt)]增长。该方法无标记、无酶催化放大，但PEG链提高单分子质量信号。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
选择性由三项阴性对照验证：仅PEG-GFLG悬臂梁在缓冲液中频率稳定；裸悬臂梁加入CTSB无频率偏移，说明非特异吸附可忽略；仅PEG悬臂梁加入CTSB无偏移，说明CTSB特异性切割GFLG而非PEG。MALDI-TOF显示完整PEG-GFLG单链质量8.64 zg，切割后PEG-GF为8.30 zg；AFM显示肽固定增加粗糙度、酶切后降低。四个悬臂梁在0.28、1.12、1.53、1.61 mM CTSB下切割肽质量分别为0.44、1.96、2.18、2.71 ng。原位0.28 mM时kp=1.19×10^-4 min^-1，速率随浓度线性增加，R=1.15 mM^-1 min^-1；液体中Q≈4。未报告RSD、回收率或方法对比。作者认为可用于无标记疾病诊断和药物设计。
传感器的构成
- 基底/换能器：硅微悬臂梁（silicon microcantilever, RTSEP-Tap300, Veeco），尺寸约125×30×3 μm，力常数约40 N/m，干空气基频约269 kHz，作为机械换能器响应质量变化
- 表面氨基化层：3-氨基丙基三甲氧基硅烷（3-aminopropyltrimethoxysilane, APTES）硅烷化修饰，提供氨基用于共价偶联
- 识别/底物层：聚乙二醇化四肽GFLG（PEGylated GFLG, PEG-GFLG；Gly-Phe-Lys-Gly偶联PEG-COOH），经EDC/NHS固定，作为CTSB特异性水解底物并增加质量信号
- 被测物：组织蛋白酶B（Cathepsin B, CTSB），在酸性PBS（pH 5）中由Cys25/His159催化切割GFLG
- 液体样品池：O-ring液体池（O-ring liquid cell，约50 μL），用于缓冲液中原位监测
- 信号读出：AFM控制器（Nanoscope V, Picoforce, Veeco）测量共振-振幅曲线并输出共振频率偏移
中文摘要
本文报道了一种基于液体中浸没式共振微悬臂梁的纳米机械生物传感器，用于原位监测组织蛋白酶B（Cathepsin B, CTSB）对四肽GFLG（Gly-Phe-Lys-Gly）的水解。传感器表面经氨基化修饰后，通过EDC/NHS化学偶联固定聚乙二醇化GFLG（PEG-GFLG）肽链。当CTSB在酸性磷酸盐缓冲液中催化切割GFLG时，部分肽链从悬臂梁表面释放，导致悬臂梁总质量下降，其基频相应升高。通过测量干空气和液体中的共振频率偏移，可定量计算被切割肽链的质量及水解效率，并实现15小时实时原位监测。结果表明，水解效率随CTSB浓度变化，且液体中频率偏移随时间符合Langmuir动力学模型，可提取水解速率常数。该无标记纳米机械方法可用于表征特定细胞蛋白酶的动力学，为疾病机制研究和智能药物设计提供工具。
英文摘要
Characterization and control of proteolysis of peptides by specific cellular protease is a priori requisite for effective drug discovery. Here, we report the nanomechanical, in situ monitoring of proteolysis of peptide chain attributed to protease (Cathepsin B) by using a resonant nanomechanical microcantilever immersed in a liquid. Specifically, the detection is based on measurement of resonant frequency shift arising from proteolysis of peptides (leading to decrease of cantilever's overall mass, and consequently, increases in the resonance). It is shown that resonant microcantilever enables the quantification of proteolysis efficacy with respect to protease concentration. Remarkably, the nanomechanical, in situ monitoring of proteolysis allows us to gain insight into the kinetics of proteolysis of peptides, which is well depicted by Langmuir kinetic model. This implies that nanomechanical biosensor enables the characterization of specific cellular protease such as its kinetics.