组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
SARS冠状病毒核衣壳蛋白（SARS-CoV nucleocapsid protein, N protein；重组GST-N蛋白），样品基质：PBS缓冲液、10倍稀释人血清
检测原理
PMMA光纤去包层表面化学固定anti-N-1捕获抗体，BSA封闭非特异位点。样品中GST-N被捕获后，加入由DyLight 649标记anti-N-2抗体与Au-PA（20 nm金纳米颗粒-蛋白A）组成的LSPCF探针。anti-N-2识别GST-N，蛋白A连接荧光抗体，金纳米颗粒产生局域表面等离子体（LSP），在纳米尺度增强局部电磁场并激发邻近DyLight 649荧光。658 nm激光经光纤激发，增强荧光（中心674 nm）经680.4 nm窄带滤光片由PMT和锁相放大器检测。未结合探针扩散离开倏逝场，信号下降；结合量随GST-N浓度增加，荧光信号在0.1 pg/mL至1 ng/mL范围内线性增加。放大策略包括LSP增强、多荧光团探针、蛋白A间隔避免猝灭及近场荧光收集。
检测灵敏度
LOD: 0.1 pg/mL（PBS）；LOD: 0.1 pg/mL（10倍稀释人血清，相当于未稀释血清1 pg/mL）；线性范围: 0.1 pg/mL–1 ng/mL（PBS与10倍稀释人血清）；PBS: y = 0.0122 Ln(x) + 0.0206, R^2 = 0.9469；稀释血清: y = 0.0096 Ln(x) + 0.0337, R^2 = 0.9624；相比ELISA提高至少10^4倍
效应效果
该传感器在PBS中可检测0.1 pg/mL GST-N，在10倍稀释人血清中检出限为0.1 pg/mL，相当于未稀释血清约1 pg/mL；PBS与稀释血清线性相关系数分别为0.9469和0.9624。PBS中不同浓度信噪比优于9，表明可区分0.1 pg/mL目标蛋白与血清蛋白背景噪声。与相同单克隆抗体的常规夹心ELISA相比，ELISA在PBS中约12.5–25 ng/mL、稀释血清中约0.78–1.56 ng/mL才可检测，LSPCF光纤生物传感器灵敏度至少提高10^4倍。夹心免疫配置提高特异性，作者认为其适合SARS-CoV早期临床诊断，并具高通量芯片化应用潜力。
传感器的构成
- 基底/换能器：PMMA多模塑料光纤（PMMA multimode optical fiber，1 mm），去包层段形成反应区并导光。
- 识别元件：anti-N-1单克隆抗体（anti-N-1 mAb）化学吸附于去包层光纤表面，捕获GST-N。
- 封闭层：BSA-PBS（10 mg/mL BSA）封闭非特异结合位点。
- 信号纳米材料：Au-PA（20 nm GNP conjugate protein A）提供局域表面等离子体增强并作为间隔/连接。
- 信号标记物：DyLight 649标记anti-N-2单克隆抗体（DyLight 649-labeled anti-N-2 mAb）识别GST-N并发射荧光。
- 光学读出：658 nm激光激发、680.4 nm窄带滤光片、PMT与锁相放大器读取荧光。
中文摘要
为增强常规免疫分析技术检测严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）核衣壳蛋白（N蛋白）的灵敏度，作者开发了一种局域表面等离子体耦合荧光（LSPCF）光纤生物传感器，将夹心免疫分析与LSP技术相结合。实验中，在缓冲液中重组SARS-CoV N蛋白（GST-N）浓度与荧光信号在0.1 pg/mL至1 ng/mL范围内呈线性关系；在稀释血清中也可在相近范围测定GST-N蛋白浓度。两种测定的线性相关系数分别为0.9469和0.9624。与常规酶联免疫吸附试验（ELISA）相比，使用相同单克隆抗体时，LSPCF光纤生物传感器对GST-N蛋白的检出限至少提高10^4倍。因此，该传感器能够检测血清中极低浓度（约1 pg/mL）的SARS-CoV N蛋白，有望用于SARS感染的早期诊断。
英文摘要
In order to enhance the sensitivity of conventional immunoassay technology for the detection of SARS coronavirus (SARS-CoV) nucleocapsid protein (N protein), we developed a localized surface plasmon coupled fluorescence (LSPCF) fiber-optic biosensor that combines sandwich immunoassay with the LSP technique. Experimentally, a linear relationship between the fluorescence signal and the concentration of recombinant SARS-CoV N (GST-N) protein in buffer solution could be observed from 0.1 pg/mL to 1 ng/mL. In addition, the concentration of GST-N protein in diluted serum across a similar range could also be measured. The correlation coefficients (linear scale) for these two measurements were 0.9469 and 0.9624, respectively. In comparison with conventional enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), the detection limit of the LSPCF fiber-optic biosensor for the GST-N protein was improved at least 10(4)-fold using the same monoclonal antibodies. Therefore, the LSPCF fiber-optic biosensor shows an ability to detect very low concentration (approximately 1 pg/mL) of SARS-CoV N protein in serum. The biosensor should help with the early diagnosis of SARS infection.