组成图示
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传感器类型
其他（OWLS光波导光模光谱生物传感器）
检测对象
血管内皮生长因子（VEGF，VEGF165）；样品基质：重组VEGF蛋白溶液（25 mM Tris-HCl，pH 8.0）
检测原理
OWLS芯片经3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）处理引入氨基，再用2.5%戊二醛在线活化形成醛基，通过胺基-醛基偶联将重组KDR3固定于表面，并用5 mM赖氨酸封闭剩余醛基。当含不同浓度VEGF的样品以25 μL/min流经微流控池时，VEGF与固定化KDR3特异性结合，使光波导/液界面吸附蛋白质量密度增加。OWLS通过测量有效折射率NTE和NTM的连续变化，将界面质量密度M转换为时间响应曲线。结合相按dM/dt=kaC(Mmax-M)进行线性化，由dM/dt对M的斜率求ka；洗脱相按ln(M0/Mt)=kd(t-t0)求kd；KD=kd/ka。VEGF浓度越高，结合速率和平衡质量响应越大，从而实现无标记实时动力学监测。
检测灵敏度
未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
KDR3在HUVEC增殖实验中表现出对VEGF的特异性中和作用：在10 ng/mL VEGF刺激下，700 ng/mL KDR3使细胞增殖抑制33%，说明其可竞争性结合VEGF。OWLS固定化KDR3的质量密度为41.80 ng/cm2，该芯片可重复使用10次以上且质量密度无明显损失，表明固定化层具有较好稳定性。与细胞实验和SPR等已有方法相比，该方法无需放射性标记和二次标记，可实时获得结合/解离动力学；所得KD=1.2×10^-6 M低于全受体报道值，作者认为与仅使用单个Ig域及不同测量体系有关。作者主张该平台可用于筛选改良可溶性VEGFR和高亲和力抗KDR抗体，并拓展到抗原/抗体动力学研究。
传感器的构成
- 基底/换能器：OWLS光波导芯片（OW2400，Microvacuum），通过NTE/NTM折射率变化转换界面质量密度
- 硅烷化修饰层：3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，10%，pH 3.5），在芯片表面引入氨基
- 交联固定层：戊二醛（Glutaraldehyde，2.5%），与氨基反应形成醛基以共价固定KDR3
- 识别元件：重组人VEGFR-2胞外域3（KDR3，Trx-His融合蛋白），特异性结合VEGF
- 封闭剂：赖氨酸（Lysine，5 mM），封闭未反应醛基，降低非特异结合
- 微流控/再生：微流控卡盒（microfluidics cartridge）输送样品，5 M NaCl再生芯片，25 mM Tris-HCl（pH 8.0）作背景缓冲液
中文摘要
本研究报道了人血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）胞外域3（KDR3）的高表达、纯化及其与VEGF实时结合的生物传感器检测。重组KDR3在大肠杆菌中表达，经阳离子交换色谱和固定化金属亲和色谱（IMAC）纯化，纯度约95%，产量26 mg/L。通过人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖实验验证其生物学活性，700 ng/mL KDR3可中和10 ng/mL VEGF的促增殖作用，抑制率达33%。采用无标记光波导光模光谱（OWLS）生物传感器实时监测VEGF与固定化KDR3的结合，获得结合速率常数ka=4.2×10^3 M^-1 s^-1、解离速率常数kd=5.1×10^-3 s^-1，解离常数KD=1.2×10^-6 M。该参数可作为设计改良可溶性VEGFR和评价抗KDR抗体的基线，OWLS平台也可用于配体/受体及抗原/抗体动力学研究。
英文摘要
Vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2) plays an important role in stimulating the proliferation of endothelial cells and improving the permeability of blood vessels, which is involved in tumor angiogenesis, a process that is essential for tumor growth and metastasis. In this study, we describe a method for high yield of recombinant extracellular domain 3 (KDR3) of human VEGFR-2 in an Escherichia coli system with further purification by cation exchange chromatography and immobilized metal affinity chromatography (IMAC). The biological activity of recombinant KDR3 was performed by sequestering VEGF in HUVEC proliferation assay. The real-time binding of human VEGF to immobilized KDR3 was monitored by a label-free biosensor, Optical waveguide lightmode spectroscopy (OWLS). Under the given experimental conditions, the association rate constant k(a) was 4.2 x 10(3) M(-1) s(-1) and the dissociation rate k(d) was 5.1 x 10(-3) s(-1). The dissociation constant K(D) was then calculated to be 1.2 x 10(-6) M. The obtained values will serve as baseline parameters for the design of improved versions of recombinant soluble VEGF receptors and the evaluation of developed anti-KDR antibodies. In addition, such a scenario established by the use of OWLS will potentiate the kinetic study of ligand/receptor and antigen/antibody. The receptor discussed here, which block VEGF binding to cell membrane KDR, have potential clinical application in the treatment of cancer and other diseases where pathological angiogenesis is involved.