组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
抗假结核棒状杆菌磷脂酶D（PLD）外毒素抗体（anti-PLD antibodies）；样品基质：羊血清（sheep serum）
检测原理
该检测采用无标记SPR光学换能。重组PLD蛋白经NHS/EDC氨基偶联固定于CM5芯片表面，形成识别层。羊血清样品以80倍稀释后流过芯片，其中抗PLD抗体与固定PLD特异性结合，使传感器界面质量/折射率增加，导致SPR共振条件改变，仪器以响应单位（RU）实时记录结合量。信号大小随血清中抗PLD抗体浓度增加而增加，稀释系列呈近似线性。为降低复杂血清基质中的非特异结合，样品稀释液中加入12 mg/mL CM dextran sodium salt，并用空白CM5参考流池扣除背景。检测后用20 mM NaOH再生芯片，实现连续样品分析。
检测灵敏度
未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数；正对照约400 RU，负对照约20 RU，判定阈值8.1%。
效应效果
方法对复杂羊血清基质具有较好抗干扰能力，加入CM dextran后非特异响应降至约20 RU，正对照约400 RU，区分明显。92份参考血清连续检测，批内CV为0.33–9.76%，一个离群值13.48%，83%样本CV<5%。单个流池可完成306次分析，264次结合-再生循环后正对照响应下降21%。与Lelystad ELISA比较，诊断敏感性86%、特异性76%；与间接PLD ELISA比较，阳性一致率95.5%，阴性一致率91.3%，总体一致率91.3%，仅8份结果不一致且多数接近阈值。作者认为SPR方法快速、无标记、实时、自动化，适合兽医实验室用于CLA血清学诊断。
传感器的构成
- SPR换能芯片：Biacore 3000 CM5传感器芯片，提供表面等离子共振光学检测界面
- 羧甲基葡聚糖修饰层：CM5 dextran表面，提供氨基偶联位点
- 活化/偶联化学：NHS和EDC活化羧基，使重组PLD蛋白氨基共价固定
- 识别元件：重组磷脂酶D（rPLD）蛋白，捕获羊血清中抗PLD抗体
- 封闭剂：1 M乙醇胺（ethanolamine，pH 8.5）封闭未反应NHS基团
- 样品处理剂：12 mg/mL羧甲基葡聚糖钠盐（CM dextran sodium salt）加入HBS稀释液，竞争抑制非特异结合
- 再生剂：20 mM NaOH，洗脱结合抗体并恢复芯片表面
中文摘要
干酪样淋巴结炎（CLA）是由假结核棒状杆菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）引起的一种影响羊和山羊的疾病，早期感染难以检测。本研究建立了一种基于表面等离子共振（SPR）的生物传感器检测方法，用于检测羊血清中针对该菌磷脂酶D（PLD）外毒素的抗体。方法采用重组PLD蛋白通过氨基偶联化学固定于CM5传感器芯片表面，并系统优化了非特异性结合抑制、血清稀释度和芯片再生条件。研究首先利用实验感染羊和未感染羊血清验证方法可行性，随后对临床样本进行检测，并与双夹心ELISA结果比较。结果显示SPR检测与ELISA具有超过90%的一致性，证实了该无标记、实时、自动化检测方法的分析价值，为CLA的兽医血清学诊断提供了新途径。
英文摘要
Caseous lymphadenitis (CLA), a disease affecting sheep and goats, is caused by Corynebacterium pseudotuberculosis and is difficult to detect, especially at early stages in its development. A surface plasmon resonance-based biosensor assay for the detection of antibodies to the phospholipase D (PLD) exotoxin of C. pseudotuberculosis in sheep serum was successfully generated. It employed a recombinant form of PLD, which was immobilised, and all aspects of the assay including minimisation of non-specific binding, and the regeneration of the chip, were optimised. The applicability of the assay was initially demonstrated using sera collected from experimentally infected sheep and from sheep with no prior history of infection. The assay was then evaluated on a panel of clinical samples and the results obtained compared very favourably to those obtained by a double sandwich ELISA (over 90% similarity) and clearly verified its analytical value.