组成图示
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传感器类型
其他（生物发光报告酶/成像探针）
检测对象
报告基因表达（gene expression）、荧光素酶活性（luciferase activity）；样品基质：HEK293 细胞裂解液、纯化酶溶液、活体组织成像（应用）
检测原理
荧光素酶催化 D-荧光素（LH2）与 Mg-ATP 生成荧光素腺苷酸，后者在活性位点与 O2 反应，形成激发态氧化荧光素；激发态回到基态时发射红光。若报告基因驱动 Ppy RE8/Ppy RE9 表达，则细胞裂解液中酶量随基因表达水平增加，单位时间内产生的光子数增加，60 s 积分光强随之升高。检测采用 600 nm 长通滤光片选择红光，PMT/微孔板读数仪将光子转换为电信号并积分输出。系统无需外部激发光源，背景低；加入 CoA 并优化 LH2、Mg-ATP 浓度可提高光输出和稳定性，密码子优化提高哺乳动物细胞表达量，从而增强灵敏度。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率、相关系数。
效应效果
Ppy RE8/RE9 发射峰 617 nm（25 ℃），37 ℃ 为 618/617 nm，接近 CBR（617/619 nm）。热失活 50% 时间分别为 3.5 h、6.0 h，CBR 为 5.5 h；8 h 后保留 28%、42%。4 ℃ CBA 中 6 个月保持 >90% 活性。HEK293 裂解液中，密码子优化使 Ppy RE8/RE9 的 60 s 积分活性提高 6.7 和 9.5 倍；优化底物加 CoA 时，Ppy RE9、Ppy RE8、CBR 为 8.6×10^7、4.8×10^7、0.1×10^7 RLU，Ppy RE9 比 CBR 高 97 倍；LAR 中 Ppy RE9/RE8 比 CBR 高 40/21 倍。作者认为适合双颜色报告和活体成像。
传感器的构成
- 表达/反应载体：HEK293 细胞裂解液，提供表达 Ppy RE8/Ppy RE9 或 CBR 的细胞内酶源
- 识别/报告元件：Ppy RE8/Ppy RE9 红色发光荧光素酶（或 CBR），催化底物氧化并产生红光
- 发光底物：D-荧光素 LH2，经腺苷酸化后与 O2 反应生成激发态氧化荧光素
- 能量底物：Mg-ATP，为荧光素腺苷酸化提供 ATP 和 Mg2+
- 信号优化剂：CoA，优化细胞裂解液报告检测中的光输出与信号稳定性
- 反应介质：25 mM glycylglycine buffer（pH 7.8），维持酶活与反应条件
- 信号读出：Varioskan Flash 多模微孔板读数仪/PMT，配 600 nm 长通滤光片，积分 60 s 读取光强
中文摘要
北美萤火虫 Photinus pyralis 荧光素酶（Luc）发射黄绿光（557 nm），已广泛用于基因报告检测、全细胞生物传感器测量和活体成像。具有红移生物发光且比活性较高的荧光素酶变体可与绿色发光酶配对用于双颜色报告检测，也可单独用于活体成像。本研究以先前报道的红色发光热稳定突变体为模板，通过定点突变技术构建两种发射峰更红、同时保持满意比活性和热稳定性的荧光素酶。新酶在 HEK293 细胞中表达，在模型报告检测中表现与 Promega 密码子优化叩甲红色荧光素酶（CBR）相当。当萤火虫荧光素酶变体经密码子优化并采用优化底物浓度复测时，其积分光强比叩甲酶提高 50–100 倍。结果表明，新酶有望在双颜色报告和活体成像中提供更好性能，并说明密码子优化对哺乳动物细胞检测的重要性。
英文摘要
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