组成图示
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传感器类型
其他（质谱肽生物传感器）
检测对象
Abl激酶活性（Abl kinase activity）；样品基质：活完整HEK293 FKBP-Abl细胞及细胞裂解液
检测原理
TAT肽介导多模块传感器肽穿过细胞膜进入活细胞，SH3结合模块增强其与Abl激酶SH3域的相互作用，使c-Abl特异性底物肽接近激酶活性中心。Abl激酶将底物肽上的酪氨酸磷酸化，磷酸化肽质量增加，磷酸化比例随Abl活性升高而升高；加入imatinib后Abl被抑制，磷酸化信号下降。细胞裂解后，302 nm紫外光裂解连接子释放生物素化报告片段，链霉亲和素磁珠通过生物素-链霉亲和素作用富集该片段，洗脱后与CHCA基质共点样。MALDI-TOF MS在负离子线性模式检测磷酸肽与未磷酸肽峰，磷酸肽峰积分相对未磷酸肽峰反映激酶活性。该方法无酶催化放大，但亲和富集提高信噪比，质谱可同时对多种肽传感器进行多重检测。
检测灵敏度
LOD: 未报告；线性范围: 未报告；灵敏度斜率: 未报告；R^2: 未报告；磷酸化检出阈值: 约1–5%（approximately 1–5% phosphorylation）
效应效果
该传感器在诱导并激活FKBP-Abl的HEK293细胞中，15 min即可出现磷酸化，4 h后MALDI-TOF MS可稳健检测磷酸肽；未诱导细胞几乎无磷酸化，10 μM imatinib可完全抑制磷酸化，表明对Abl激酶具有较好选择性。肽浓度≥50 μM出现底物抑制，≤25 μM未显著影响内源Abl Y245、Stat5 Y695和CrkL Y207磷酸化；4 h时>50 μM对Abl Y245自磷酸化有显著影响（P<0.01）。数据来自生物学n≥3和技术三点重复，未报告RSD、回收率或长期稳定性。与Western blot相比，MALDI-TOF MS通量更高且可多重检测，但低磷酸化（<1–5%）灵敏度有限；作者认为可扩展为癌细胞激酶活性和抑制剂响应多重检测工具。
传感器的构成
- 识别/底物模块：c-Abl特异性激酶底物肽（EAIYAAPFAKKKbG，含酪氨酸磷酸化位点），作为Abl识别与磷酸化元件
- 靶向模块：Abl-SH3结合配体肽（SH3-binding ligand），增强肽与Abl SH3域相互作用
- 递送模块：TAT肽（TAT peptide），介导传感器跨膜进入活细胞
- 连接模块：光裂解连接子（photocleavable linker，3-(2-nitrobenzyl)-3-aminopropionic acid衍生物），UV 302 nm释放报告片段
- 亲和标签：生物素（biotin/biotinylated reporter），用于链霉亲和素磁珠捕获
- 信号标记：磷酸基团（phosphate group），Abl磷酸化后改变肽质量并产生质谱信号
- 捕获/富集层：链霉亲和素包被磁珠（streptavidin-coated MagneSpheres），从细胞裂解液富集生物素化片段
- 质谱读出层：α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）基质与Voyager 4800 MALDI-TOF/TOF质谱仪，检测磷酸肽信号
中文摘要
许多癌症以蛋白磷酸化改变为特征，激酶失调可驱动恶性增殖。慢性髓系白血病中费城染色体导致Bcr-Abl融合激酶组成性激活，伊马替尼等抑制剂可诱导缓解，但长期治疗易出现耐药。现有激酶检测方法多不能同时检测多个底物或难以在完整细胞中定量。本文报道一种新型肽生物传感器，用于检测过表达CML模型Abl激酶构建体的活完整细胞中Abl激酶活性及对抑制剂的敏感性。该传感器包含c-Abl特异性磷酸化底物模块、Abl-SH3结合靶向模块、TAT跨膜递送模块、光裂解连接子和生物素亲和标签。肽进入细胞后被Abl磷酸化，细胞裂解后经紫外光裂解释放生物素化报告片段，用链霉亲和素磁珠富集，再以MALDI-TOF质谱检测磷酸肽峰，从而反映激酶活性和药物响应。该方法简单、可多重扩展，有望成为监测癌细胞激酶活性和抑制剂响应的工具。
英文摘要
Many cancers are characterized by changes in protein phosphorylation as a result of kinase dysregulation. Disruption of Abl kinase signaling through the Philadelphia chromosome (causing the Bcr-Abl mutation) in chronic myeloid leukemia (CML) has provided a paradigm for development of kinase inhibitor drugs such as the specific inhibitor imatinib (also known as STI571 or Gleevec). However, because patients are treated indefinitely with this drug to maintain remission, resistance is increasingly becoming an issue. Although there are many ways to detect kinase activity, most lack the ability to "multiplex" the analysis (i.e., to detect more than one substrate simultaneously). Here we report a novel biosensor for detecting Abl kinase activity and sensitivity to inhibitor in live intact cells overexpressing a CML model Abl kinase construct. This straightforward methodology could eventually provide a new tool for detecting kinase activity and inhibitor drug response in cancer cells that overexpress oncogenic kinases.