组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
D-丝氨酸（D-serine）；样品基质：脑细胞外液/脑组织（大鼠纹状体细胞外液，in vivo）及PBS体外校准
检测原理
DAAO立体特异性催化D-丝氨酸氧化脱氨，生成亚胺酸和还原型FADH2；FADH2被O2氧化再生FAD并产生H2O2，亚胺酸随后水解为α-酮-3-羟基丙酸和NH3。H2O2穿过PPD/Nafion复合膜到达Pt–Ir表面，在+700 mV（vs Ag/AgCl）发生两电子氧化，产生与D-丝氨酸浓度相关的安培电流。PPD/Nafion允许H2O2透过并阻挡AA等电活性干扰物，提高选择性；信号遵循Michaelis–Menten动力学，线性区斜率反映灵敏度。
检测灵敏度
LOD: 20 ± 1 nM；线性范围: 0–50 μM；灵敏度: 61 ± 7 μA cm−2 mM−1；R^2 = 0.999；t90%: 0.7 ± 0.1 s
效应效果
该传感器对L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸（≤5 mM）和D-天冬氨酸（≤0.1 mM）无可测响应；D-丙氨酸灵敏度为D-丝氨酸的2倍（119±5 μA cm−2 mM−1），但脑内D-丝氨酸浓度高约两个数量级。多巴胺、尿酸、DOPAC、5-HIAA、HVA等干扰SX%<0.06%，AA选择性SAA%=0.05±0.1%。4℃保存tL50约6个月，连续使用3天灵敏度由60±1降至55±3 μA cm−2 mM−1。大鼠纹状体植入后微注射5 μL 100 mM D-丝氨酸产生60±0.01 pA稳态电流，空白电极无信号，适合脑内高时间分辨率监测。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：Pt–Ir（90/10%）微盘电极（PtD，125 μm直径，Teflon包覆线），提供电子转导并氧化H2O2
- 第一修饰层：聚邻苯二胺（PPD），循环伏安电聚合形成选择性膜，允许H2O2透过并阻挡抗坏血酸（AA）
- 第二修饰层：Nafion（1%酒精溶液浸涂5次），增强AA阻挡、密封电极边缘并维持H2O2通透性
- 交联固定层：戊二醛（GA，25%水溶液处理5 min），与DAAO交联固定并保持酶活性
- 识别元件：哺乳动物D-氨基酸氧化酶（DAAO，猪肾来源，600 U/mL），立体特异性催化D-丝氨酸氧化脱氨
- 信号产物/电子供体：H2O2（酶反应原位生成，O2为电子受体），在Pt表面+700 mV氧化产生安培电流
中文摘要
D-丝氨酸作为脑内信使/胶质递质，促进神经信号和突触可塑性，需要灵敏工具监测脑内D-丝氨酸以理解胶质细胞释放机制。本文开发用于直接固定电位安培监测D-丝氨酸的生物传感器，将哺乳动物D-氨基酸氧化酶（DAAO）固定在Nafion包覆的聚邻苯二胺（PPD）修饰Pt–Ir微盘电极上。PPD与Nafion复合层使酶活性和传感器效率较单层提高约2倍。获得稳态响应时间t90% 0.7±0.1 s（n=8），检出限20±1 nM（n=8）。圆柱几何灵敏度低于盘状几何（盘状：61±7 μA cm−2 mM−1，n=4，R2=0.999）。抗坏血酸（AA）等中枢神经电活性分子干扰可忽略。电极植入大鼠脑纹状体并微注射D-丝氨酸，证明可在脑组织体内检测D-丝氨酸。
英文摘要
D-serine has been implicated as a brain messenger, promoting not only neuronal signalling but also synaptic plasticity. Thus, a sensitive tool for D-serine monitoring in brain is required to understand the mechanisms of D-serine release from glia cells. A biosensor for direct fixed potential amperometric monitoring of D-serine incorporating mammalian D-amino acid oxidase (DAAO) immobilized on a Nafion coated poly-ortho-phenylenediamine (PPD) modified Pt-Ir disk electrode was therefore developed. The combined layers of PPD and Nafion enhanced the enzyme activity and biosensor efficiency by approximately 2-fold compared with each individual layer. A steady state response time (t(90%)) of 0.7+/-0.1s (n=8) and limit of detection 20+/-1 nM (n=8) were obtained. Cylindrical geometry showed lower sensitivity compared to disk geometry (61+/-7 microA cm(-2) mM(-1), (n=4), R(2)=0.999). Interference by ascorbic acid (AA), the main interference species in the central nervous system and other neurochemical electroactive molecules was negligible. Implantation of the electrode and microinjection of D-serine into rat brain striatal extracellular fluid demonstrated that the electrode was capable of detecting D-serine in brain tissue in vivo.