组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
钙离子（Ca2+）、caspase-7活性/凋亡（caspase-7/apoptosis）；样品基质：活细胞（Cos-7细胞胞内）
检测原理
FRET融合蛋白探针由供体CFP/Cerulean、传感识别域和受体YFP/Venus通过柔性linker共价连接。当Ca2+结合CaM、Ecad12或TNXL等传感域时，传感域发生构象变化，例如CaM由伸展态变为紧凑态、Ecad12发生二聚化，使CFP与YFP的距离和取向改变，从而改变FRET效率；当caspase-7识别并切割DEVD肽时，供体与受体被分离，FRET效率下降。荧光显微镜激发CFP后，同时检测CFP发射和YFP发射，通过YFP/CFP比值或FRET效率变化反映胞内Ca2+浓度或凋亡蛋白酶活性。该策略无需外源标记，信号随识别事件实时变化，并可借助计算建模优化动态范围。
检测灵敏度
未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
文中未报告LOD、线性范围、RSD、回收率或与ELISA、qPCR等方法的定量对比。作者展示计算建模与盒式克隆对FRET探针设计的价值：CEcadY12预测Ca2+结合后FRET效率增加3.6%，体外实测增加14%；结合态CFP-YFP距离由91 Å缩短至85 Å，取向因子由0.59降至0.39，FRET效率由3.1%升至4.5%。活细胞成像中，10 µM ATP或1 µM ionomycin触发Ca2+响应，5 µM STS诱导凋亡并导致vDEVDc的FRET下降。盒式载体通过荧光筛选简化多结构域组装，适用于实时监测Ca2+、凋亡和亚细胞转位。
传感器的构成
- 换能荧光对：CFP/Cerulean与YFP/Venus，分别作为FRET供体和受体，通过距离/取向变化产生信号
- 传感识别域：CaM、Ecad12、TNXL或DEVD肽，响应Ca2+结合或caspase-7切割
- 柔性连接肽：linkers，连接各结构域并允许构象变化
- 纯化标签：6x-His，用于Ni-NTA亲和纯化
- 亚细胞定位肽：HIV TAT transduction domain，靶向核仁/核
- 表达载体盒式系统：pCfvtx、pCFPtx、pEcad12vtx、pHisC12Ytx、pTatC12Ytx，用于多结构域融合蛋白组装
- 活细胞成像基底：Cos-7细胞与玻璃底培养皿，承载探针并供显微镜观察
中文摘要
许多荧光探针依赖荧光蛋白对之间的荧光共振能量转移（FRET）来报告细胞事件。当融合传感蛋白响应细胞事件发生构象变化时，供体与受体之间的能量转移效率随之改变，因此可通过FRET效率变化关联目标分子或细胞过程。本文介绍基于结构的计算设计策略：利用候选FRET生物传感器各结构域的三维结构，对柔性连接区进行构象采样，并预测距离因子、取向因子和FRET效率变化，从而筛选具有更大动态范围的融合蛋白探针。FRET生物传感器通常由供体荧光蛋白、传感域和受体荧光蛋白至少三个结构域融合而成。为高效构建多结构域融合蛋白，作者提出盒式载体系统，通过标准化限制性酶切位点和荧光筛选，快速组装常用结构域并生成盒式文库。构建后的FRET探针可转染活细胞，并用荧光显微镜实时监测Ca2+信号、凋亡和亚细胞转位等事件。
英文摘要
Many fluorescent probes depend on the fluorescence resonance energy transfer (FRET) between fluorescent protein pairs. The efficiency of energy transfer becomes altered by conformational changes of a fused sensory protein in response to a cellular event. A structure-based approach can be taken to design probes better with improved dynamic ranges by computationally modeling conformational changes and predicting FRET efficiency changes of candidate biosensor constructs. FRET biosensors consist of at least three domains fused together: the donor protein, the sensory domain, and the acceptor protein. To more efficiently subclone fusion proteins containing multiple domains, a cassette-based system can be used. Generating a cassette library of commonly used domains facilitates the rapid subcloning of future fusion biosensor proteins. FRET biosensors can then be used with fluorescence microscopy for real-time monitoring of cellular events within live cells by tracking changes in FRET efficiency. Stimulants can be used to trigger a range of cellular events including Ca(2+) signaling, apoptosis, and subcellular translocations.