组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
DB293（小分子小沟结合剂，minor-groove-binding agent）；样品基质：HBS-EP/HBS-N 缓冲液中的 DB293 溶液
检测原理
将 DNA 发夹双链通过生物素-链霉亲和素或氨基-羧甲基葡聚糖化学共价固定于 SPR 芯片表面，形成生物特异性识别界面。未标记小分子 DB293 随缓冲液流过芯片时，与 DNA 小沟结合，使传感器表面结合质量与局部折射率增加。表面等离子共振角随之改变，仪器以共振单位（RU）实时记录结合与解离过程。稳态 RU 随 DB293 浓度变化，可拟合得到平衡常数 Ka、化学计量 n 和协同因子；动力学传感器图全局拟合可得到结合速率 ka 和解离速率 kd。该方法无需标记，适合强结合但信号弱的小分子-核酸体系。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该方法无需标记即可定量小分子-DNA 相互作用，对强结合但光谱/量热信号弱的体系优于传统光学或量热法。示例中 DB293 与 AATT 呈 1:1 结合，与 ATGA 呈 2:1 协同二聚结合，CF=9.6；ATGA K1=0.41×10^7 M^-1、K2=0.98×10^7 M^-1，AATT K1=4.87×10^7 M^-1。AATT 动力学 ka=6.75×10^5 M^-1 s^-1、kd=0.0155 s^-1、KA=4.35×10^7 M^-1，与稳态 KA=4.87×10^7 M^-1 一致，chi^2=0.278。通过空白流路扣除、缓冲液匹配和低表面密度固定，可消除 bulk shift 和非特异吸附，适用于药物-核酸相互作用研究。
传感器的构成
- SPR换能基底：Biacore CM5/CM4/SA/HPA 传感器芯片，提供表面等离子共振检测表面
- 化学修饰层：CM5/CM4 芯片表面羧甲基葡聚糖（CM dextran）经 EDC/NHS 活化形成反应性酯，用于共价固定链霉亲和素或氨基-DNA
- 识别捕获层：链霉亲和素（streptavidin）固定于芯片表面，捕获 5′/3′-生物素标记 DNA 发夹双链（AATT、ATGA、ATAT）
- 识别元件：生物素标记 DNA 发夹双链（biotin-labeled DNA hairpin duplexes）或氨基标记 DNA，提供小分子结合位点
- 脂质体仿生层：HPA 芯片上吸附脂质体（liposomes），用于固定胆固醇偶联 DNA（cholesterol-conjugated DNA hairpin）
- 封闭/钝化层：乙醇胺盐酸盐（ethanolamine hydrochloride）钝化剩余活性酯；BSA 封闭 HPA 芯片暴露疏水区域
- 信号标记物：无外源标记，DB293（minor-groove-binding agent）结合本身产生 SPR 质量响应
中文摘要
表面等离子共振（SPR）技术与生物传感器表面已成为研究核酸相互作用且无需标记的常用工具。该方法可同时对生物分子相互作用以及小分子-生物大分子结合进行动力学和平衡表征，实时监测分子相互作用，并对强结合但光谱信号或反应热较小的体系具有显著优势。本文提供了使用 SPR-生物传感器方法进行核酸相互作用分析的详细实用指南，介绍了 SPR 技术原理与基本基础，给出了仪器准备、传感器芯片和样品制备建议，以及实验设计、定量与定性数据分析和结果呈现的详细信息。文中以一个小沟结合剂与 DNA 的相互作用为例，分别采用动力学和稳态 SPR 方法进行评估，以说明该技术。由于能协同结合特定 DNA 序列的分子在许多应用中具有吸引力，文中还展示了一种协同小分子-DNA 相互作用。
英文摘要
Surface plasmon resonance (SPR) technology with biosensor surfaces has become a widely-used tool for the study of nucleic acid interactions without any labeling requirements. The method provides simultaneous kinetic and equilibrium characterization of the interactions of biomolecules as well as small molecule-biopolymer binding. SPR monitors molecular interactions in real time and provides significant advantages over optical or calorimetic methods for systems with strong binding coupled to small spectroscopic signals and/or reaction heats. A detailed and practical guide for nucleic acid interaction analysis using SPR-biosensor methods is presented. Details of the SPR technology and basic fundamentals are described with recommendations on the preparation of the SPR instrument, sensor chips, and samples, as well as extensive information on experimental design, quantitative and qualitative data analysis and presentation. A specific example of the interaction of a minor-groove-binding agent with DNA is evaluated by both kinetic and steady-state SPR methods to illustrate the technique. Since the molecules that bind cooperatively to specific DNA sequences are attractive for many applications, a cooperative small molecule-DNA interaction is also presented.