组成图示
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传感器类型
其他（压电悬臂梁生物传感器）
检测对象
Acholeplasma laidlawii（赖德氏无脂支原体，A. laidlawii）；样品基质：PBS缓冲液、含5% FCS的DMEM细胞培养基/细胞培养样品
检测原理
PEMC传感器工作于共振模式，PZT层压电激励使悬臂梁在约900 kHz附近振动。金表面通过半胱胺/戊二醛或链霉亲和素固定抗A. laidlawii抗体。当样品中的支原体与表面抗体特异性结合时，识别事件使悬臂梁有效质量增加，导致共振频率下降；频率变化与结合质量呈对数线性关系。随后加入第二抗体与已捕获支原体结合，进一步增加质量并提高特异性，类似无标记夹心检测。阻抗分析仪实时读取频率变化，无需荧光或酶标记。在PBS中响应较强，在含血清和细胞的DMEM中响应约降低50%，但仍可在10^3–10^7 CFU/mL范围内检测。
检测灵敏度
LOD: <10^3 CFU/mL（细胞培养基）；线性范围（动态范围）: 10^3–10^7 CFU/mL（PBS/DMEM）；PBS中 Δf = 310.14 log(C_Al) − 77.212，R^2 = 0.98；阳性对照体积 Δf = 758.79 log(C) + 174.78，R^2 = 0.96；质量校准 R^2 = 0.99
效应效果
传感器在含5% FCS的DMEM、A431细胞（5×10^6 CFU/mL）和E. coli JM101（10^7 CFU/mL）背景中无显著频率下降，抗干扰性好；DMEM密度变化引起约330 Hz可逆偏移。PBS响应比DMEM高约50%。PEMC在PBS和细胞培养基中LOD低于10^3 CFU/mL，动态范围10^3–10^7 CFU/mL；平行ELISA对活菌和灭活菌LOD均为10^7 CFU/mL，灵敏度提高约4个数量级。检测时间小于1 h，23个传感器共振频率在900±30 kHz内，ELISA活菌与灭活菌结果相差约10–15%。作者认为适合细胞培养快速支原体监测。
传感器的构成
- 基底/换能器：PZT（lead zirconate titanate）压电陶瓷层与石英（quartz）层粘接构成PEMC悬臂梁，PZT提供压电激励与机电换能，石英提供机械梁结构
- 电极与封装：30号导线焊接至PZT电极，环氧树脂固定于玻璃管，聚氨酯（polyurethane）旋涂绝缘，用于电信号输入输出与保护
- 金属修饰层：传感器尖端溅射100 nm金（Au），提供抗体固定表面并增强界面化学相容性
- 自组装/交联层：2 mM半胱胺（cysteamine）在金表面形成氨基自组装层，2.5%戊二醛（glutaraldehyde）交联固定抗体
- 识别元件：抗Acholeplasma laidlawii多克隆抗体（cpAb或bpAb，Roche试剂盒），特异性捕获支原体
- 亲和固定层：链霉亲和素（streptavidin）修饰金表面，用于结合生物素化抗体bpAb
- 确认/信号元件：第二抗A. laidlawii多克隆抗体（cpAb），结合已捕获支原体，增加质量并确认特异性
- 样品/缓冲液：PBS或含5% FCS的DMEM细胞培养基，作为流动相与检测基质
中文摘要
本文报道了一种基于压电激励毫米级悬臂梁（PEMC）生物传感器检测细胞培养样品中支原体的新方法。PEMC 传感器通过共振频率变化响应表面质量变化，具有飞克级质量灵敏度，并可在液体中直接进行无标记检测。作者以常见细胞培养污染菌赖德氏无脂支原体（Acholeplasma laidlawii）为对象，分别使用商业支原体 ELISA 试剂盒阳性对照和 ATCC 23206 校准菌株，在 PBS 与含 5% 胎牛血清的 DMEM 培养基中进行检测。传感器表面固定抗 A. laidlawii 抗体，支原体结合引起共振频率下降，并用第二抗体结合进一步确认阳性。结果显示，PEMC 在细胞培养基中的检出限低于 10^3 CFU/mL，而平行 ELISA 的检出限为 10^7 CFU/mL。该方法检测时间短、灵敏度高，可用于细胞培养系统的快速支原体污染监测。
英文摘要
In this article we report a new biosensor-based method that is more sensitive and rapid than the current approach for detecting mycoplasma in cell culture samples. Piezoelectric-excited millimeter-sized cantilever (PEMC) sensors respond to mass change via resonant frequency change. They are sensitive at femtogram level and can be used directly in liquid for label-free detection. Common cell culture contaminant, Acholeplasma laidlawii was detected in both buffer and cell culture medium. Two different sources (positive control from a commercial kit and ATCC 23206) were analyzed using antibody-immobilized PEMC sensor. Resonant frequency decrease caused by binding of A. laidlawii was monitored in real-time using an impedance analyzer. Positive detection was confirmed by a second antibody binding. The limit of detection (LOD) was lower than 10(3) CFU/mL in cell culture medium using PEMC sensor while parallel ELISA assays showed LOD as 10(7) CFU/mL. This study shows that PEMC sensor can be used for sensitive and rapid mycoplasma detection in cell culture samples.