组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
Ras 活性（Ras-GTP）、Ras-Raf 相互作用；样品基质：HeLa/COS7 活细胞（EGF 刺激）
检测原理
Raichu-Ras 探针由 mYFP、K-Ras、Raf-RBD 和 mTFP/mCFP 串联组成。静息状态下，探针内 Ras 主要以 GDP 结合态存在，Raf-RBD 与 Ras 分离，供体 mTFP/mCFP 与受体 mYFP 距离较远，FRET 效率低。EGF 刺激后，细胞内 GEF 促进 Ras 上 GDP/GTP 交换，形成 Ras-GTP；Ras-GTP 与 Raf-RBD 结合，使探针构象闭合，供体与受体距离缩短，FRET 效率升高。倒置荧光显微镜在 440 nm 激发下采集 480 nm 供体发射和 530 nm FRET 发射，计算 FRET/TFP 或 FRET/CFP 比值，比值升高反映 Ras-GTP/Ras-Raf 结合水平。Shoc2 结合 Ras-GTP 并加速其与 Raf 的结合与解离，使 FRET 上升更快、空间分布更广泛。
检测灵敏度
时间常数: 对照 1.5 min；Shoc2 敲低 9.9 min；COS7 对照 12.1 min；Shoc2 过表达 6.3 min
效应效果
Shoc2 敲低使 EGF 诱导的 pMEK 和 pERK 降低约四分之一至二分之一，并轻微延迟；但 pull-down 显示 Shoc2 缺失升高基础与 EGF 刺激的 Ras-GTP，提示作用位于 Ras 下游。FRET 成像中，对照 HeLa 细胞时间常数为 1.5 min，Shoc2 敲低为 9.9 min（p<0.01）；COS7 对照为 12.1 min，Shoc2 过表达降至 6.3 min（p<0.01）。20 min 时 FRET/TFP 比值相近。GST-Shoc2 可 GTP 依赖地拉下 Raichu-Ras-V12 和 EGFP-K-Ras-V12，显示结合特异性。作者认为 Shoc2 是 Ras-Raf 信号的空间与时间放大器，FRET 探针可用于活细胞实时监测 Ras 活性。
传感器的构成
- 成像基底：35-mm 玻璃底培养皿（collagen type I 包被），承载细胞并用于倒置荧光显微镜 FRET 成像
- 表达载体：pCX4bsr-Raichu-Ras 或 pRaichu-Ras，用于在 HeLa/COS7 细胞中稳定或瞬时表达探针
- 供体荧光蛋白：mTFP（monomerized teal fluorescent protein）或 mCFP，作为 FRET 供体，与受体距离变化产生信号
- 识别元件：K-Ras（氨基酸 1–172）与 Raf-RBD（c-Raf 氨基酸 51–131）串联，Ras-GTP 结合 Raf-RBD 引起构象闭合
- 受体荧光蛋白：mYFP（yellow fluorescent protein），作为 FRET 受体，供体-受体距离缩短时 FRET 效率升高
- 探针组成域：K-Ras COOH 端高变区（氨基酸 169–188），构成 Raichu-Ras 探针的 C 端部分
中文摘要
Shoc2/SUR-8 作为 Ras 和 Raf 的支架蛋白正向调控 Ras/ERK MAP 激酶信号。本研究利用基于荧光共振能量转移（FRET）的生物传感器并结合计算模型，考察 Shoc2 在 Ras 时空调控中的作用。在表皮生长因子（EGF）刺激的 HeLa 细胞中，RNA 介导的 Shoc2 敲低使 MEK 和 ERK 磷酸化降低约半最大抑制，但不影响 Ras 激活。为实时监测 Ras 与 Raf 的结合，作者使用一种 FRET 生物传感器，其中 Ras 与 Raf 的 Ras 结合域串联连接，并被供体与受体荧光蛋白夹在中间用于 FRET 测量。该传感器发现 Shoc2 是 EGF 刺激后 Ras 与 Raf 快速相互作用所必需的。为阐明动力学机制，作者建立两个计算模型解释 Shoc2 在 Ras-ERK 信号中的作用；其中 Shoc2 加速器模型能合理解释实验观察，即 Shoc2 同时加速 Ras-Raf 相互作用的结合与解离。作者提出 Shoc2 主要通过加速 Ras-Raf 相互作用调控 Ras-ERK 信号通路的时空模式。
英文摘要
Shoc2/SUR-8 positively regulates Ras/ERK MAP kinase signaling by serving as a scaffold for Ras and Raf. Here, we examined the role of Shoc2 in the spatio-temporal regulation of Ras by using a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensor, together with computational modeling. In epidermal growth factor-stimulated HeLa cells, RNA-mediated Shoc2 knockdown reduced the phosphorylation of MEK and ERK with half-maximal inhibition, but not the activation of Ras. For the live monitoring of Ras binding to Raf, we utilized a FRET biosensor wherein Ras and the Ras-binding domain of Raf were connected tandemly and sandwiched with acceptor and donor fluorescent proteins for the FRET measurement. With this biosensor, we found that Shoc2 was required for the rapid interaction of Ras with Raf upon epidermal growth factor stimulation. To decipher the molecular mechanisms underlying the kinetics, we developed two computational models that might account for the action of Shoc2 in the Ras-ERK signaling. One of these models, the Shoc2 accelerator model, provided a reasonable explanation of the experimental observations. In this Shoc2 accelerator model, Shoc2 accelerated both the association and dissociation of Ras-Raf interaction. We propose that Shoc2 regulates the spatio-temporal patterns of the Ras-ERK signaling pathway primarily by accelerating the Ras-Raf interaction.