组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
Rac1 GTPase 活性（Rac1 activity）、Cdc42 GTPase 活性（Cdc42 activity）；样品基质：活 Jurkat T 细胞、A431 癌细胞培养体系。
检测原理
检测基于Raichu-Rac1分子生物传感器的构象变化。当Jurkat T细胞表面的CD3受体与玻璃底培养板上包被的抗CD3抗体结合时，T细胞受体信号激活Rac1，使Rac1-GTP与PAK的CRIB结合区结合，传感器由开放态转为闭合态，eGFP与mRFP1距离缩短，FRET效率升高。偏振光激发eGFP后，FRET使mRFP1产生敏化发射；由于供体偏振激发而受体取向相对自由，敏化发射发生去偏振，受体各向异性随FRET效率升高而降低。Quadview偏振成像器同时采集平行/垂直偏振的eGFP和mRFP1图像，经G因子、背景与串扰校正后计算各向异性。直接激发mRFP1作为对照，可排除浓度与光路影响。该方法无需酶促或核酸放大，依靠1:1供受体化学计量和偏振各向异性实现高动态范围读出。
检测灵敏度
未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率、相关系数；原文报告各向异性变化分辨约 ~0.004。
效应效果
系统在96孔板中约20 min完成双通道成像，孔间均一性高；rhodamine B校准显示各向异性可在0.04–0.28间变化，可分辨约0.004的变化。曝光200–800 ms时FWHM由0.12降至0.06，帧平均1–10帧时由0.11降至0.05，说明信噪比优化后各向异性稳健。A431细胞中直接激发mRFP1各向异性约0.3，敏化发射约0.13，96孔间几乎无差异。活Jurkat T细胞30 min、1 s曝光、5 s间隔成像，可追踪CD3刺激后Rac1活性的时空变化，无需强度法谱串扰校正，时间分辨率优于TCSPC，作者认为可用于药物库、RNAi和活细胞高内容筛选。
传感器的构成
- 换能/样品基底：玻璃底多孔培养板/盖玻片（glass-bottom multi-well plate/coverglass），承载细胞并支持宽场偏振显微成像
- 刺激修饰层：抗CD3单克隆抗体UCHT1（anti-CD3 mAb UCHT1），包被玻璃内表面，结合T细胞CD3受体并触发信号
- 样品/细胞基质：Jurkat T细胞（human T-cell line）表达Raichu-Rac1；A431癌细胞（A431）表达Raichu-Cdc42用于96孔验证
- 识别/传感元件：Raichu-Rac1生物传感器（Rac1 GTPase + PAK CRIB domain），识别Rac1-GTP结合状态并发生构象变化
- 供体信号标记：增强绿荧光蛋白（eGFP），作为FRET供体，被偏振光激发后向mRFP1转移能量
- 受体信号标记：单体红荧光蛋白（mRFP1），作为FRET受体，其敏化发射各向异性反映FRET效率
- 光学换能/读出：偏振分束器、半波片、Quadview偏振成像器、CCD（Orca-ER），将偏振荧光转换为各向异性信号
中文摘要
本文报道了一种基于荧光各向异性的时间分辨FRET显微成像方法，用于动态监测活T细胞中Rac1活性。作者利用由增强绿荧光蛋白（eGFP）和单体红荧光蛋白（mRFP1）构成的Raichu生物传感器，通过供体-受体间FRET效率变化反映Rac1构象与活性。该传感器被表达于Jurkat T细胞中，细胞表面CD3受体与包被抗CD3抗体的玻璃底多室培养板结合后，触发下游Rac1激活。系统采用偏振分辨宽场显微镜和高内容筛选平台，同时采集平行与垂直偏振的供体/受体发射图像，计算敏化发射各向异性。结果显示，该方法可在5 s时间间隔、30 min内追踪生物传感器活性的时空变化，避免传统强度法所需的谱串扰校正，并比单光子计数荧光寿命成像具有更高的时间分辨率，适用于蛋白相互作用的高内容动态筛选。
英文摘要
We present recent data on dynamic imaging of Rac1 activity in live T-cells. Förster resonance energy transfer between enhanced green and monomeric red fluorescent protein pairs which form part of a biosensor molecule provides a metric of this activity. Microscopy is performed using a multi-functional high-content screening instrument using fluorescence anisotropy to provide a means of monitoring protein-protein activity with high temporal resolution. Specifically, the response of T-cells upon interaction of a cell surface receptor with an antibody coated multi-well chamber was measured. We observed dynamic changes in the activity of the biosensor molecules with a time resolution that is difficult to achieve with traditional methodologies for observing Förster resonance energy transfer (fluorescence lifetime imaging using single photon counting or frequency domain techniques) and without spectral corrections that are normally required for intensity based methodologies.