组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
乙醇（ethanol, EtOH）；选择性研究涉及甲醇（methanol）、正丁醇（n-butanol）；样品基质：酒精饮料（gin、whisky、tequila、raki、vodka）、酵母发酵液
检测原理
该传感器以 AOX 为生物识别元件。乙醇进入 PAMAM 修饰层后，被 AOX 催化氧化为乙醛，同时消耗溶解氧并生成过氧化氢。由于工作电位固定在 -0.7 V（vs Ag/AgCl），电极主要发生溶解氧还原反应；乙醇浓度升高使酶促反应消耗更多 O2，导致氧还原电流下降，电流变化 ΔI 与乙醇浓度成正比。PAMAM 树状大分子和戊二醛交联提供多孔、高氨基密度界面，有利于乙醇和 O2 扩散，并稳定 AOX 四聚体结构。相比在 +0.7 V 检测 H2O2，-0.7 V 氧消耗模式可避免发酵液基质干扰。甲醇氧化生成的甲醛可再被 AOX 氧化，因此甲醇信号可能放大；AOX 对伯醇有选择性，2-丙醇基本无响应。
检测灵敏度
LOD: 0.016 mM；线性范围: 0.025–1.0 mM；FIA 线性方程: y = 0.270x + 0.118 (R^2 = 0.997)
效应效果
传感器对伯醇选择性良好，2-丙醇无信号；甲醇因甲醛可再被 AOX 氧化而信号放大。4°C 储存 1 个月后保留 67% 初始灵敏度；连续操作 8 h 活性损失 2%，FIA 66 次注射 210 min 损失 11.64%。0.2 和 0.5 mM 乙醇 RSD 为 0.8% 和 4.9%，0.5 mM 重复 CV 3.3%，FIA 0.7 mM CV 5.65%。酒精饮料回收率 94.2%–104%，无明显基质效应；酵母发酵液结果与 HPLC 一致，可用于饮料检测和发酵过程监测。
传感器的构成
- 基底/换能器：金电极（Au），经氧化铝抛光和循环伏安清洗，作为电化学换能器
- 自组装单分子层：半胱胺（cysteamine, Cys）通过 Au-S 键自组装，提供表面氨基
- 交联连接层：戊二醛（glutaraldehyde, GA）与 Cys 氨基反应，用于共价连接 PAMAM
- 树状大分子修饰层：第四代氨基末端聚酰胺胺（G4 PAMAM-NH2），提供高密度氨基和生物相容微环境
- 还原稳定层：硼氢化钠（NaBH4）还原席夫碱，稳定 PAMAM 与电极表面连接
- 识别/生物催化元件：酒精氧化酶（AOX，Pichia pastoris），催化乙醇氧化并消耗 O2
- 酶交联稳定层：戊二醛（GA）交联 AOX 与 PAMAM 表面氨基，实现多点共价固定并稳定酶四聚体
中文摘要
本文报道了一种高稳定性、高灵敏度的安培法醇类生物传感器。将酒精氧化酶（AOX）通过第四代聚酰胺胺（PAMAM）树状大分子固定在半胱胺修饰的金电极表面，戊二醛作为交联剂实现酶与树状大分子的多点共价连接。乙醇检测基于 AOX 催化乙醇氧化并消耗溶解氧，在 -0.7 V（vs Ag/AgCl）下监测氧还原电流下降，并与乙醇浓度相关。作者优化了 pH、酶量等参数。优化后的乙醇传感器在 0.025–1.0 mM 范围内呈良好线性，响应时间约 100 s，检出限为 0.016 mM。表征包括线性、操作与储存稳定性、重现性、重复性和底物特异性。4°C 储存 1 个月后仍保留 67% 初始灵敏度。该传感器还用于流动注射分析模式，并应用于多种酒精饮料中乙醇测定及酵母发酵过程的离线监测。
英文摘要
A highly stable and sensitive amperometric alcohol biosensor was developed by immobilizing alcohol oxidase (AOX) through Polyamidoamine (PAMAM) dendrimers on a cysteamine-modified gold electrode surface. Ethanol determination is based on the consumption of dissolved oxygen content due to the enzymatic reaction. The decrease in oxygen level was monitored at -0.7 V vs. Ag/AgCl and correlated with ethanol concentration. Optimization of variables affecting the system was performed. The optimized ethanol biosensor showed a wide linearity from 0.025 to 1.0 mM with 100 s response time and detection limit of (LOD) 0.016 mM. In the characterization studies, besides linearity some parameters such as operational and storage stability, reproducibility, repeatability, and substrate specificity were studied in detail. Stability studies showed a good preservation of the bioanalytical properties of the sensor, 67% of its initial sensitivity was kept after 1 month storage at 4 degrees C. The analytical characteristics of the system were also evaluated for alcohol determination in flow injection analysis (FIA) mode. Finally, proposed biosensor was applied for ethanol analysis in various alcoholic beverage as well as offline monitoring of alcohol production through the yeast cultivation.