组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
环肽抑制剂 c-Xaa（cyclopeptides, cyclo[-Arg-Gly-Asp-ψ(triazole)-Gly-Xaa-]，含 c-Lys、c-Gly、cRGDfK 等）；样品基质：SPR运行缓冲液（10 mM HEPES buffered saline, pH 7.4）
检测原理
SPR检测基于无标记实时光学换能。首先用NHS/EDC活化CM5芯片表面的羧基化葡聚糖层，再通过氨基偶联将整合素αvβ3固定于芯片，并用乙醇胺封闭剩余活化基团。当含RGD基序的环肽c-Xaa随缓冲液流过芯片时，其RGD序列与整合素αvβ3受体结合，形成复合物。结合事件使芯片表面质量增加，改变金膜表面等离子体共振条件，导致反射光信号变化，以响应单位（RU）记录。被测环肽浓度越高，达到平衡时结合的分子数越多，RU响应越大；解离阶段信号下降。软件按1:1 Langmuir模型全局拟合结合与解离曲线，得到平衡解离常数KD。该过程无酶或荧光放大，信号直接反映识别事件引起的界面质量变化。
检测灵敏度
KD: c-Lys 1.3 × 10–9 M；c-Gly 2.4 × 10–6 M；cRGDfK 1.3 × 10–6 M；χ2(c-Lys) = 0.79
效应效果
SPR结果显示，c-Lys的KD为1.3 × 10–9 M，显著低于参考分子cRGDfK（1.3 × 10–6 M）；c-Gly为2.4 × 10–6 M，其余环肽KD均大于10–6 M。c-Lys拟合χ2为0.79，所有化合物χ2均小于10，模型拟合良好。对接中cRGDfNMeV最佳构象与X射线构象RMSD为0.234 Å，验证位点模型可靠；LigScore1使活性化合物排名靠前。LigPlot显示c-Lys与9个残基形成氢键、3个残基形成疏水作用，而c-Leu仅3个弱氢键且RGD偏离口袋。作者认为c-Lys可作为新型αvβ3抑制剂候选分子，该平台可用于基于结构的抑制剂发现。
传感器的构成
- 基底/换能器：CM5传感器芯片（Biacore CM5）：SPR换能基底与羧基化葡聚糖表面，提供光学响应和固定位点
- 活化层：NHS/EDC活化液（0.1 M NHS、0.4 M EDC）：活化葡聚糖表面羧基，形成氨基反应性酯
- 识别元件：整合素αvβ3（integrin αvβ3）：氨基偶联固定于芯片，作为受体识别RGD环肽
- 封闭剂：乙醇胺（ethanolamine）：封闭未反应活化基团，降低非特异结合
- 分析物：环肽c-Xaa（cyclo[-Arg-Gly-Asp-ψ(triazole)-Gly-Xaa-]）：含RGD基序的整合素抑制剂，作为流动相分析物
- 运行/再生介质：10 mM HEPES缓冲盐液（含150 mM NaCl、1 mM MgCl2、1 mM MnCl2、5 mM n-octyl-β-D-glucoside，pH 7.4）与10 mM甘氨酸（pH 2.2）：维持结合条件并再生芯片
- 信号读出：Biacore X100与BIAevaluation 4.1：无标记SPR实时记录响应单位（RU），拟合结合动力学与KD
中文摘要
整合素是参与血管生成并在多种肿瘤中高表达的异二聚体细胞表面受体，其RGD识别位点是设计αvβ3抑制剂的重要结构基础。本研究采用表面等离子共振（SPR）生物传感器技术和分子对接模拟，系统考察多种环肽抑制剂与整合素αvβ3的结合特征。实验使用Biacore X100仪器和CM5芯片，通过NHS/EDC活化与氨基偶联将整合素αvβ3固定于芯片表面，以含RGD基序的环肽c-Xaa为分析物，在0–100 μM浓度范围内进行无标记实时结合检测。SPR结果显示，环肽c-Lys的平衡解离常数KD为1.3×10^-9 M，显著低于参考分子cRGDfK的1.3×10^-6 M，提示其具有更高结合亲和力。基于整合素αvβ3晶体结构（PDB: 1L5G）构建三维模型，并用LigandFit进行分子对接；LigScore1评分和LigPlot相互作用分析表明，活性最强的c-Lys与受体形成多个氢键和疏水作用，其预测结合位点与已知结构一致，而活性较弱的c-Leu相互作用较弱且RGD基序偏离结合口袋。结果表明c-Lys可作为新型整合素αvβ3抑制剂候选分子，该工作可为基于结构的αvβ3抑制剂发现提供平台。
英文摘要
Integrins play critical roles in the process of angiogenesis and are attractive targets for anticancer therapies. It is desirable to develop new types of small-molecule inhibitors of integrin. Herein, the binding features of several inhibitors to integrin alpha(v)beta(3) have been studied by surface plasmon resonance (SPR) biosensor technology and molecular docking analyses. The SPR results indicated that the equilibrium dissociation constant (K(D)) values are evaluated for the inhibitors and showed that the K(D) value of cyclopeptide c-Lys is much lower than the reference molecule. In addition, the 3D structural model of integrin alpha(v)beta(3) was generated according to the crystal structure of the integrin alpha(v)beta(3) complex, and the molecular docking simulation analyses revealed that the predicted binding sites for the most active cyclopeptide c-Lys were consistent with the reported structure. These results thus implied that cyclopeptide c-Lys could be developed as a novel inhibitor for integrin alpha(v)beta(3). The current work has potential for application in structure-based integrin alpha(v)beta(3) inhibitor discovery.