组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
乙酰胆碱酯酶（AChE）、丁酰胆碱酯酶（BChE）、羧酸酯酶（CaE）、神经病变靶酯酶（NTE）；样品基质：人、大鼠、小鼠枸橼酸抗凝全血及全血裂解液
检测原理
全血裂解液中的酯酶催化特定酚酯或胆碱酯底物水解，分别释放酚或胆碱。酚传感器中，酪氨酸酶催化酚与氧气反应生成醌，醌在石墨电极（-150 mV vs Ag/AgCl）被还原为儿茶酚，产生安培电流；电流随酚浓度增加而增加，从而反映 CaE 或 NTE 等酚酯酶活性。胆碱传感器中，胆碱氧化酶催化胆碱氧化生成 H2O2，H2O2 在 MnO2 修饰石墨电极（+350 mV）被检测，电流随胆碱浓度增加而增加，反映 AChE 或 BChE 活性。双电极系统同时加入酚酯和胆碱酯底物，分别记录两条安培曲线，扣除底物自发水解后，按 Michaelis–Menten 方程和灵敏度因子建立线性方程组，解算 AChE 与 BChE 的浓度。
检测灵敏度
LOD: 酚 10 nM；胆碱 100 nM；生物传感器法血液酯酶活性 LOD: 酪氨酸酶传感器约 1–2 nmol/(min × ml blood)，胆碱氧化酶传感器约 10–20 nmol/(min × ml blood)（最终血液稀释至少 1:2000）。线性范围（酶浓度，×10^10 M）: 乙酰胆碱+乙酸苯酯 AChE 2.2–32.8、BChE 7.7–44.4；乙酰胆碱+戊酸苯酯 AChE 2.2–28.5、BChE 2.1–53.2；丁酰胆碱+乙酸苯酯 AChE 2.2–26.3、BChE 7.7–35.5。灵敏度斜率 ks (A/M s): 乙酰胆碱+乙酸苯酯 AChE 1.1±0.1、BChE 1.76±0.03；乙酰胆碱+戊酸苯酯 AChE 0.94±0.01、BChE 1.6±0.1；丁酰胆碱+乙酸苯酯 AChE 0、BChE 6.45±0.07；乙酸苯酯 AChE 0.16±0.02、BChE 0.19±0.02；戊酸苯酯 AChE 0、BChE 0.63±0.10；乙酸苯酯（丁酰胆碱对）AChE 0.12±0.01、BChE 0.17±0.01。
效应效果
生物传感器法与分光光度法对 AChE、BChE 和 CaE 结果一致，方法间变异系数约 6.7%（人血 AChE）至 30%（大鼠血 AChE）。全血稀释至少 1:100 时无干扰，高稀释可减轻抗坏血酸、尿酸干扰；单次酚、胆碱测定平均 2 min 和 3 min，10 次测量 CV 分别为 6% 和 1%。双电极同时测定 AChE/BChE 时，15 个二元混合物平均偏差最大不超过 13%，乙酰胆碱+戊酸苯酯体系 AChE、BChE 偏差分别为 5% 和 3%。人血 NTE 活性 42.5±4.28 nmol/min/ml，与既往 32.3±3.6 nmol/min/ml 相近；全血 1:100–1:50 稀释内信号线性。作者认为可用于有机磷暴露生物监测并扩展多路酯酶检测。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：石墨棒（graphite rods, d=3 mm）作为工作电极，提供电子传递界面。
- 电化学修饰层：MnO2 层（由 MnCl2/NH4Cl 在 +600 mV 电沉积）用于胆碱氧化酶传感器，作为 H2O2 敏感/催化层。
- 聚电解质修饰层：PDMDAACl（poly(dimethyldiallylammonium chloride), MW 400–500 kDa）通过 LBL 形成纳米结构膜，静电吸附并固定酶。
- 酚识别酶：酪氨酸酶（tyrosinase, EC 1.14.18.1）催化酚氧化生成醌，醌在电极还原产生安培信号。
- 胆碱识别酶：胆碱氧化酶（choline oxidase, EC 1.1.3.17）催化胆碱氧化生成 H2O2，H2O2 在 MnO2 电极被检测。
- 交联固定剂：戊二醛（glutaraldehyde, 1% w/v）交联酶分子，增强膜稳定性。
中文摘要
本文回顾已发表数据并报道血液酯酶生物传感器检测的新结果。作者基于纳米结构聚电解质膜开发了酪氨酸酶和胆碱氧化酶安培生物传感器，用于检测酚和胆碱。以酚酯和胆碱酯为底物，在枸橼酸抗凝的人、大鼠和小鼠全血裂解液中定量测定乙酰胆碱酯酶（AChE）、丁酰胆碱酯酶（BChE）、羧酸酯酶（CaE）和神经病变靶酯酶（NTE）活性。生物传感器法与分光光度法在 AChE、BChE 和 CaE 测定中结果一致；NTE 因无法在全血中分光光度测定而未直接比较。文中还建立了整合酚和胆碱传感器的双电极系统，可同时测定 AChE 和 BChE，并开发线性方程算法计算混合物中各组分浓度，二元混合物平均误差约 6%。该工作为构建多路酯酶检测系统、用于有机磷化合物暴露生物监测提供了基础。
英文摘要
This paper reviews our previously published data and presents new results on biosensor assay of blood esterases. Tyrosinase and choline oxidase biosensors based on nanostructured polyelectrolyte films were developed for these purposes. Experiments were performed on the quantitative determination of acetylcholinesterase (AChE), butyrylcholinesterase (BChE), carboxylesterase (CaE), and neuropathy target esterase (NTE) in samples of whole blood of rats, mice, and humans. Good agreement was found between biosensor and spectrophotometric assays for AChE, BChE, and CaE. No direct comparison could be made for NTE because its activity cannot be measured spectrophotometrically in whole blood. A new method of simultaneous quantitative determination of AChE and BChE in test mixtures is also described. This method represents a bifunctional biosensor for the simultaneous analysis of choline and phenol based on integration of individual sensors. Algorithms for calculation of separate concentrations of AChE and BChE in the mixture were developed. The mean error of calculated component concentrations was approximately 6% for binary test mixtures. The present work provides a foundation for building multiplexed systems for the simultaneous determination of multiple esterases with applications to biomonitoring for exposures to organophosphorus compounds.