组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
大肠杆菌DNA连接酶（E. coli DNA ligase）；样品基质：Tris-HCl/MgCl2/NAD+/NADH/BSA缓冲液（酶稀释液/反应缓冲液）
检测原理
发夹DNA探针经巯基固定在Au膜上，cDNA1与cDNA2同环区杂交形成含缺口的双链。E. coli DNA ligase识别该缺口并催化3′-OH与5′-磷酸形成磷酸二酯键，使发夹探针由柔性茎环结构转变为刚性线性双螺旋。界面质量与折射率变化引起SPR谷角偏移；酶浓度越高，连接事件越多，构象变化越大，SPR响应越大。该方法无标记，利用酶催化连接和探针构象转变实现信号放大，可实时监测连接过程。
检测灵敏度
LOD: 0.6 nM；线性范围: 0.6 nM–60 mM（对数坐标）；r = 0.997
效应效果
该方法具有良好选择性：当两段靶链均为羟基末端时几乎无SPR响应，而含5′-磷酸/3′-羟基缺口底物产生明显响应；单碱基突变实验显示连接效率受缺口处几何结构影响，可区分不同突变。重现性良好，至少三次重复测量RSD均小于8%。检出限0.6 nM，低于部分电化学方法，与发夹DNA荧光法及FRET法相当，且无需标记、流程简单、成本较低。阿的平（Quinacrine）对60 mM连接酶呈剂量依赖性抑制，约0.58 mM时抑制50%，表明可用于NAD+依赖DNA连接酶抑制剂筛选。
传感器的构成
- 基底/换能器：BK7玻璃片溅射2 nm Cr和50 nm Au膜，作为SPR换能基底
- 识别元件：5′-巯基发夹DNA探针（hairpin DNA probe）通过Au-S键自组装固定于Au膜，提供环区杂交位点
- 杂交靶链：cDNA1（5′-p-ATC AAG ACA-3′）和cDNA2（5′-GAC GGG AGA-3′）与发夹环区杂交，形成含缺口的双链底物
- 封闭剂：6-巯基-1-己醇（MCH）封闭Au表面非特异性结合位点
- 反应缓冲体系：Tris-HCl/MgCl2/NAD+/NADH/BSA缓冲液，提供NAD+依赖连接酶活性环境
中文摘要
本文利用发夹DNA探针在DNA连接过程中的自结构变化，结合自制高分辨率表面等离子共振（SPR）仪器，建立了一种灵敏、无标记且简便的大肠杆菌DNA连接酶（E. coli DNA ligase）活性检测方法。该方法可实时监测DNA连接过程，并考察单碱基突变对连接过程的影响。实验表明，当发夹探针与含5′-磷酸和3′-羟基的两段靶DNA杂交形成缺口双链后，DNA连接酶催化缺口连接，使探针由茎环结构转变为刚性线性双螺旋，引起SPR谷值显著偏移。基于此，作者完成了大肠杆菌DNA连接酶定量检测，获得0.6 nM的检出限、更宽的浓度范围和更好的重现性。此外，还研究了阿的平（Quinacrine）对酶活性的抑制作用，表明该方法可用于药物筛选。
英文摘要
Using hairpin DNA probe self-structure change during DNA ligation process, a sensitive, label-free and simple method of E. coli DNA ligase assay via a home-built high-resolution surface plasmon resonance (SPR) instrument was developed. The DNA ligation process was monitored in real-time and the effects of single-base mutation on the DNA ligation process were investigated. Then an assay of E. coli DNA ligase was completed with a lower detection limit (0.6 nM), wider concentration range and better reproducibility. Moreover, the influence of Quinacrine on the activity of E. coli DNA ligase was also studied, which demonstrated that our method was useful for drug screening.