组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
目标 DNA（target DNA，互补序列及双错配序列）；样品基质：PBS 缓冲液（pH 7.4）
检测原理
发夹探针固定于金表面，目标DNA杂交使发夹打开，3′端生物素暴露，链霉亲和素-HRP结合。HRP在H2O2存在下催化H2Q氧化为BQ，BQ生成量与目标DNA浓度成正比。SECM采用基底产生-尖端收集（SG/TC）模式，Pt超微电极在-0.3 V还原BQ，稳态还原电流随目标DNA浓度增加而增大；扫描尖端可获得ds-DNA杂交点图像。酶催化提供信号放大，超微电极稳态检测降低背景电流，提高信噪比和检出限。
检测灵敏度
LOD: 17 pM（0.017 nM）；线性范围: 0.045 nM–900 nM；log-log 相关系数: 0.997
效应效果
该方法对互补目标DNA与含两个错配碱基的目标DNA具有良好选择性；SECM扫描曲线显示450 nM互补目标形成的ds-DNA点平台还原电流约-2.90 nA，约为双错配目标的4倍，表明可区分杂交效率差异。四个独立制备电极在45 nM互补目标检测中RSD为3.6%，重现性良好。与传统基于发夹探针的电化学DNA传感器相比，SECM方案因采用超微电极稳态检测、消除背景电流而获得更低检出限。作者认为该方法可用于ss-DNA/ds-DNA区分和错配碱基传感，并可将探针固定于玻璃片、硅片、尼龙膜等低成本基底，扩大电化学DNA传感器应用范围。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：金盘电极（Au，2 mm），固定发夹探针并作为 SECM 基底
- 自组装修饰层：己硫醇（MCH）与发夹探针混合自组装，填充空隙并形成有序单分子层
- 识别元件：发夹探针（hairpin probe），5′端己硫醇（SH(CH2)6）固定，3′端生物素（biotin），杂交后暴露生物素
- 信号标记物：链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP），通过生物素-链霉亲和素作用捕获并催化信号反应
- 酶底物/信号前体：对苯二酚（H2Q）与过氧化氢（H2O2），HRP 催化 H2Q 氧化生成对苯醌（BQ）
- 封闭剂：牛血清白蛋白（BSA），封闭非特异结合位点
- 检测探针/换能器：铂超微电极（Pt UME，10 μm），SECM 尖端，在 -0.3 V 还原 BQ 产生电流
- 辅助/参比电极：铂丝辅助电极与 Ag/AgCl 参比电极，构成三电极 SECM 测量系统
中文摘要
本文报道了一种基于发夹探针和酶催化放大的扫描电化学显微镜（SECM）DNA检测新方案。将5′端修饰己硫醇、3′端修饰生物素的发夹探针通过自组装固定于金电极表面；目标DNA与发夹探针杂交后引起探针构象变化，使3′端生物素从电极表面暴露，进而通过生物素-链霉亲和素相互作用捕获链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）。在H2O2存在下，HRP催化对苯二酚（H2Q）在修饰金表面氧化生成对苯醌（BQ），生成的BQ量与目标DNA量成正比；SECM铂微电极在溶液中还原BQ，所得稳态还原电流可用于目标DNA浓度检测和杂交成像。该方法对互补目标DNA的检出限低至17 pM，并能区分互补序列与含错配碱基序列，具有良好选择性。
英文摘要
A novel scheme for scanning electrochemical microscopy (SECM) assay of DNA based on hairpin probe and enzymatic amplification biosensor was described. In this method, streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) was captured by double-stranded DNA (ds-DNA) modified gold substrate via biotin-streptavidin interaction after hybridization of target DNA to the immobilized hairpin probe functioned with a biotin at its 3' end. In the presence of H2O2, hydroquinone (H2Q) was oxidized to benzoquinone (BQ) at the modified substrate surface through the HRP catalytic reaction, and the generated BQ corresponding to the amount of target DNA was reduced in solution by a SECM tip. The resulting reduction current allowed concentration detection of target DNA and SECM imaging of hybridization between the target DNA and the immobilized hairpin probe. The detection limit of this method was as low as 17 pM for complementary target DNA and it had good selectivity to discriminate between the complementary sequence and one containing base mismatches.