组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
流感A病毒H5血凝素（H5 hemagglutinin, HA；A/Vietnam/1203/04 H5N1重组蛋白）；样品基质：重组纯化H5蛋白缓冲液（未测临床样本，作者提出未来用于血清或呼吸道分泌物）
检测原理
丝网印刷碳电极（SPCE）工作电极经戊二醛（GA）、金纳米颗粒（AuNPs）和链霉亲和素修饰，固定生物素化糖链以模拟宿主唾液酸受体。H5血凝素（HA）与糖链特异性结合后，加入包被抗H5单克隆抗体的电活性磁性聚苯胺纳米颗粒（EAM NPs，γ-Fe2O3核/聚苯胺壳），形成糖链-H5-抗体-EAM夹心结构。EAM纳米颗粒作为直接电荷转移换能器，其聚苯胺壳在盐酸（HCl）质子掺杂下发生氧化还原转换；循环伏安法在-0.4至1 V、55 mV/s扫描下记录电流，积分得到转移电荷ΔQ。H5结合量越多，电极表面EAM/聚苯胺越多，氧化还原电荷量越大，信号随H5浓度增加而增加。AuNPs增强电子传递并放大电流。SPR用于验证HA/糖链结合和抗体中和特异性。
检测灵敏度
LOD: 1.4 μM（H5；原文报告为实验检测限）
效应效果
SPR显示H5与特异性糖链结合可被α-H5单克隆抗体1:500在H5 140 nM时中和，α-H3 1:250无交叉反应。生物传感器在H5 1.4 μM时，糖链100–500 μM的ΔQ一致；H5降至290 nM时ΔQ接近阴性对照，但仍高于阴性对照。特异性糖链-H5组合的ΔQ显著高于非结合糖链-H5组合。空白实验可重复，H5 1.4 μM在无糖链或非结合糖链时ΔQ升高但低于特异性结合，提示存在低水平非特异结合。每组n=3，报告均值±标准差，未给RSD、回收率或线性范围。作者认为该传感器快速、特异、便携、低成本，可用于现场血清/呼吸道分泌物检测及流感监测。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：丝网印刷碳电极（SPCE），碳工作电极与Ag/AgCl参比/对电极，提供电化学检测界面
- 交联修饰层：戊二醛（GA），涂覆于工作电极用于后续固定
- 导电放大层：金纳米颗粒（AuNPs），增强电子传递并放大电流响应
- 亲和固定层：链霉亲和素（Streptavidin），结合生物素化糖链
- 识别元件：生物素化合成糖链（CT/Sda、3′SLex、3′SLN），模拟唾液酸受体并特异性结合H5血凝素（HA）
- 识别/信号元件：电活性磁性聚苯胺纳米颗粒（EAM NPs，γ-Fe2O3核/聚苯胺壳）包被抗H5单克隆抗体（α-H5 mAb），识别H5并作为直接电荷转移换能器
- 封闭剂：Avidin D/生物素与酪蛋白（casein）封闭，减少非特异结合
- 质子掺杂剂：盐酸（HCl），质子化聚苯胺使其导电并产生氧化还原电流
中文摘要
流感A病毒（FLUAV）是流感感染病原体，因猪源H1N1大流行受关注。FLUAV长期引起年度流行及更严重全球大流行。本文报道一种利用电活性磁性（EAM）聚苯胺包覆纳米颗粒作为换能器的电化学生物传感器，用于基于受体特异性快速识别FLUAV毒株，有助于监测动物流感感染并评估从动物传播至人类的毒株的大流行潜力。大流行潜力取决于人传人能力，而该能力依赖于FLUAV血凝素（HA）对宿主糖基受体的特异性。禽源FLUAV优先结合α2,3连接受体，人源FLUAV结合α2,6连接受体。EAM纳米颗粒通过在γ-Fe2O3核周围合成苯胺单体制备，得到25–100 nm直径纳米颗粒，并经透射电镜和电子衍射结构表征。EAM纳米颗粒包被特异性针对H5N1（A/Vietnam/1203/04）的单克隆抗体，证明了糖链与H5结合的特异性。生物传感器结果与表征HA/糖链结合及α-H5抗体活性的表面等离子共振（SPR）辅助数据相关。该研究将EAM纳米颗粒作为换能器应用于特定、便携、易用的生物传感器，在疾病监测和生物安全方面具有潜力。
英文摘要
Influenza A virus (FLUAV), the causative agent of influenza infection, has received extensive attention due to the recent swine-origin H1N1 pandemic. FLUAV has long been the cause of annual epidemics as well as less frequent but more severe global pandemics. Here, we describe a biosensor utilizing electrically active magnetic (EAM) polyaniline-coated nanoparticles as the transducer in an electrochemical biosensor for rapidly identifying FLUAV strains based on receptor specificity, which will be useful to monitor animal influenza infections and to characterize pandemic potential of strains that have transmitted from animals to humans. Pandemic potential requires human-to-human transmissibility, which is dependent upon FLUAV hemagglutinin (HA) specificity for host glycan receptors. Avian FLUAV preferentially bind to α2,3-linked receptors, while human FLUAV bind to α2,6-linked receptors. EAM nanoparticles were prepared by synthesizing aniline monomer around gamma iron (III) oxide (γ-Fe2O3) cores, yielding 25-100-nm diameter nanoparticles that were structurally characterized by transmission electron microscopy and electron diffraction. The EAM nanoparticles were coated with monoclonal antibodies specific to H5N1 (A/Vietnam/1203/04). Specificity of binding between glycans and H5 was demonstrated. The biosensor results were correlative to supporting data from a surface plasmon resonance assay that characterized HA/glycan binding and α-H5 antibody activity. This novel study applies EAM nanoparticles as the transducer in a specific, portable, easy-to-use biosensor with great potential for disease monitoring and biosecurity applications.