组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
一氧化氮（NO）；样品基质：100 mM磷酸盐缓冲液（pH 6.8）水溶液，潜在适用于细胞/组织来源NO
检测原理
该传感器以酵母CcP为识别元件。无NO时，CcP血红素铁处于五配位高自旋状态，在645 nm处存在高自旋标记吸收带；N端标记的Atto620或Cy5发射光谱与该吸收带重叠，染料作为FRET供体，其荧光被CcP吸收带有效淬灭。NO结合到血红素铁后，645 nm高自旋吸收带消失，FRET受体吸收能力下降，供体-受体能量转移效率降低，染料荧光增强，形成开启型信号。荧光强度随NO浓度按F=F0−(F0−F∞)[NO]/([NO]+Kd)变化，Kd约10 µM，因此可在1–100 µM范围内定量。检测可逆，无需酶催化或核酸放大。
检测灵敏度
定量范围: 1 µM–100 µM；Kd: 10±1.5 µM；Kd: 9.4±0.5 µM；Kd: 12.0±2 µM；koff: 0.22±0.08 min−1；kon: 0.024±0.002 µM−1 min−1
效应效果
该传感器对NO具有良好选择性：在大量NO2−、NO3−、CO和O2存在下仍无明显干扰，NO2−仅在酸性条件下部分转化为NO引起轻微荧光上升。NO结合可逆，溶液态Atto620-CcP开关比SR为45±5%，Cy5-CcP为40±5%；包埋于TMOS溶胶-凝胶后4 °C保存20天以上仍保持活性和时间响应，但360 µM NO下Cy5溶胶-凝胶SR降至20%。溶液多次循环中荧光峰谷缓慢下降，可能与蛋白部分变性有关。作者认为该开启型FRET传感器比传统淬灭型更灵敏、更易于区分响应与器件退化，适用于巨噬细胞来源细胞外NO、工业尾气及高NO生理研究。
传感器的构成
- 基底/支撑：石英片（quartz slide），承载溶胶-凝胶层并用于前表面荧光测量
- 固化基质：四甲基正硅酸酯（TMOS）溶胶-凝胶二氧化硅（silica sol–gel），包埋固定标记CcP，提供固态可重复使用环境
- 识别元件：酵母细胞色素c过氧化物酶（CcP），血红素蛋白，NO结合位点，NO结合改变645 nm高自旋吸收带
- 信号标记/FRET供体：Cy5或Atto620 NHS酯，N端共价标记CcP，发射光谱与CcP 645 nm吸收重叠
- 被测物：一氧化氮（NO），结合CcP血红素铁，导致645 nm吸收带消失
- 读出：荧光光谱仪（Cary Eclipse），前表面激发并监测染料荧光强度变化
中文摘要
本文探索利用荧光标记的酵母细胞色素c过氧化物酶（CcP）通过Förster共振能量转移（FRET）机制监测一氧化氮（NO）至亚微米水平。NO与CcP的结合亲和力常数Kd为10±1.5 µM；NO解离速率常数koff为0.22±0.08 min−1，二级结合速率常数kon为0.024±0.002 µM−1 min−1。作者还将荧光标记CcP包埋于二氧化硅溶胶-凝胶基质中，用于固态NO传感器件。CcP无NO时存在645 nm高自旋吸收带，作为FRET受体淬灭染料荧光；NO结合后该吸收带消失，染料荧光增强，实现开启型检测。结果表明，标记CcP可成功用于快速、简便、定量且灵敏的NO传感装置，为NO检测提供了原理验证。
英文摘要
In this paper we explore the use of fluorescently labeled cytochrome c peroxidase (CcP) from baker's yeast for monitoring nitric oxide (NO) down to the sub-micromolar level, by means of a FRET (Förster Resonance Energy Transfer) mechanism. The binding affinity constant (K(d)) for the NO binding to CcP was determined to be 10+/-1.5 microM. The rate of NO dissociation from the CcP (k(off)) and the second order rate constant for the NO association (k(on)) were found to be 0.22+/-0.08 min(-1) and 0.024+/-0.002 microM(-1) min(-1) respectively. The immobilization of fluorescently labeled CcP into a polymeric matrix for use in a solid state NO sensing device was also explored. The results provide proof-of-principle that labeled CcP can be successfully implemented in a fast, simple, quantitative and sensitive NO sensing device.