组成图示
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传感器类型
化学发光生物传感器
检测对象
乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）；样品基质：人血清（human serum）、人血浆（plasma）及 Tris-HCl 缓冲标准液
检测原理
该传感器采用酶级联识别与化学发光换能。ACh 在 AChE 催化下水解为胆碱，胆碱在 ChOx 催化下氧化为甜菜碱并产生 H2O2；H2O2 在 HRP 催化下氧化 Amplex Red 生成 resorufin。resorufin 的生成量与 ACh 浓度成正比。随后，resorufin 与由 TCPO 和 4-methylimidazole 生成的 ODI 以及 H2O2 发生 ODI-CL 反应，高能中间体通过 CIEEL 机制将能量转移给 resorufin，使其发射闪光化学发光。系统采用三泵 FIA 和液体核心波导，使 resorufin 与 ODI-CL 试剂快速混合并在流动池/PMT 中读出。酶级联和 ODI-CL 提供信号放大，过量 H2O2 单独泵入以避免 resorufin 被氧化为 resazurin。
检测灵敏度
LOD: 0.14 mM；线性范围: 0.7–11.3 mM；斜率: 12444；R^2 = 0.998
效应效果
在 200 倍稀释人血清加标实验中，ACh 回收率为 94%–108%（n=7），表明方法准确且精密度良好；稀释线性研究显示各稀释倍数结果与预期值误差在 5.6% 以内。LOD 0.14 mM 低于作者引用的 MALDI-TOF MS、液相色谱-电化学发光和毛细管电泳微电极等报道方法。孵育时间 15 min，较商业 Amplex Red 荧光试剂盒的 30 min 缩短一半。作者认为该 FIA-ODI-CL 系统准确、精确、可重复，适合低成本、快速监测人血清/血浆中 ACh，可用于阿尔茨海默病或神经毒剂/有机磷暴露相关神经肌肉麻痹的现场诊断，并可发展为微流控生物传感器。
传感器的构成
- 换能器/检测池：10 mm 光程、80 μL 流动池（Agilent Technology），作为 ODI-CL 发光检测窗口。
- 液体核心波导：5.0 cm PTFE 管（OD 1/16 in），连接十字混合器与流动池，传输快速化学发光信号。
- 混合器：十字混合器（Valco VICI Cheminert，ID 0.25 mm），用于 resorufin、ODI 和 H2O2 快速混合。
- 识别/酶催化层：AChE（1.0 U/mL）、ChOx（0.5 U/mL）、HRP（0.04 U/mL）于 PBS pH 7.4，催化 ACh 水解、胆碱氧化和 Amplex Red 氧化。
- 信号底物：Amplex Red（1.0 mM），在 HRP/H2O2 作用下生成 resorufin。
- 化学发光试剂：ODI（由 TCPO 与 4-methylimidazole 反应生成）和 H2O2（异丙醇溶液，最佳 0.08 M），通过 CIEEL 能量转移激发 resorufin 发光。
- 信号读出：PMT 模块（Hamamatsu H7818-01 和 M9003），检测 resorufin 化学发光强度。
- 样品/标准缓冲：Tris-HCl（pH 8.5）用于 ACh 标准与血清样品；PBS（pH 7.4）用于酶工作液。
中文摘要
本文报道了一种基于流动注射分析（FIA）和1,10-草酰二咪唑化学发光（ODI-CL）检测的高灵敏生物传感器，用于定量乙酰胆碱（ACh）。该系统基于液体核心波导原理设计，可快速检测酶反应生成的发光产物。将 Tris-HCl（pH 8.5）中的 ACh 与含 1.0 U/mL 乙酰胆碱酯酶（AChE）、0.5 U/mL 胆碱氧化酶（ChOx）、0.04 U/mL 辣根过氧化物酶（HRP）和 1.0 mM Amplex Red 的 PBS（pH 7.4）混合，室温孵育 15 min。连续酶反应生成的 resorufin 浓度与样品中 ACh 浓度成正比。ODI-CL 检测下 ACh 定量线性校准曲线为 y=12444x+11617，R^2=0.998，线性动态范围为 0.7–11.3 mM。该生物传感器的检出限（LOD=背景噪声+3s）低至 0.14 mM。回收试验和线性研究表明，FIA-ODI-CL 系统准确、精确且可重复。
英文摘要
We developed a highly sensitive biosensor for quantifying acetylcholine (ACh) using flow injection analysis system with 1,1'-oxalyldiimidazole chemiluminescence (ODI-CL) detection designed based on the principle of liquid core waveguide. ACh in Tris-HCl (pH 8.5) was incubated with the mixture of 1.0 U/ml acetylcholinesterase, 0.5 U/ml choline oxidase, 0.04 U/ml horseradish peroxidase, and 1.0 μM Amplex Red in PBS (pH 7.4) for 15 min at room temperature. The concentration of resorufin formed from the consecutive enzyme reactions was proportional to the concentration of ACh in analytical sample. The dynamic range of linear calibration curve (y = 12444x + 11617, R2 = 0.998) for the quantification of ACh using the biosensor with ODI CL detection was 0.7∼11.3 μM. The limit of detection (LOD = background noise + 3σ) of the biosensor was as low as 0.14 μM. Based on the results of recovery test and linearity study, finally, we confirmed that FIA system with ODI CL detection is accurate, precise, and reproducible.