组成图示
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传感器类型
其他（P2X受体单通道电流ATP生物传感器）
检测对象
三磷酸腺苷（ATP）；样品基质：急性分离大鼠背根神经节（DRG）神经元及其细胞外液
检测原理
DRG神经元释放的ATP作为被测物，一方面与外翻膜片上的P2X受体结合，使离子通道开放，产生神经元诱导单通道电流（NeSCC）；ATP浓度或释放频率升高时，通道开放事件频率增加，膜片钳记录到电流事件增多。另一方面，ATP与葡萄糖在己糖激酶（HK）作用下生成葡萄糖-6-磷酸（G6P）和ADP，G6PDH催化G6P氧化并还原NADP+为NADPH，NADPH荧光增强，经UV激发和CCD成像实时读出。NA通过β3肾上腺素能受体-Gs-腺苷酸环化酶-cAMP-PKA通路促进非囊泡ATP释放，可能经CFTR外排，从而放大ATP传感信号。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该P2X单通道ATP生物传感器选择性较好：NeSCC电导37.7±1.1 pS，与ATP（100 μM）诱导的37.6±2.1 pS一致，不同于谷氨酸（1 mM）的14.1±1.8 pS，且被PPADS（10 μM）阻断。NA（100 μM）增加NeSCC频率，被普萘洛尔（10 μM）和SR59230A（100 nM）抑制，不被prazosin（1 μM）、yohimbine（2 μM）、CGP20712（300 nM）或ICI118551（50 nM）影响；siRNA敲低β3受体后NA效应消失。NADPH荧光增强同样受β3受体调控。体内L5神经结扎后痛阈由约14 g降至约2 g，SR59230A 50 mg/kg腹腔注射显著逆转，1、5、10 mg/kg无效。作者认为β3肾上腺素能受体可作为神经病理性疼痛治疗靶点。
传感器的构成
- 换能器电极：膜片电极（patch electrode），内充Cs-gluconate、CsCl、MgCl2、EGTA、HEPES、MgATP、Na2GTP溶液，用于形成外翻膜片并记录单通道电流
- 识别载体：外翻膜片（outside-out patch），取自急性分离大鼠DRG神经元膜，承载P2X受体并构成ATP识别界面
- 识别元件：P2X受体（P2X receptor），位于外翻膜片上，结合ATP后开放离子通道
- 酶促信号标记：己糖激酶（HK）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）、NADP+和葡萄糖，将ATP转化为NADPH荧光信号
- 读出设备：Axopatch-200A放大器、pClamp软件、UV激光（365±10 nm）、增强CCD相机（ARGUS-50/CA）和AQUACOSMOS软件，用于电流与荧光信号检测
中文摘要
去甲肾上腺素（NA）在外周神经损伤后伴随交感神经长入背根神经节（DRG）释放，可能增强神经病理性疼痛。ATP是疼痛介质，但NA调控DRG中ATP动员的机制尚不清楚。本研究采用急性分离大鼠DRG神经元，以外翻膜片钳记录P2X受体通道单通道电流作为ATP生物传感器，并结合实时酶促NADPH荧光成像分析ATP动员；同时利用大鼠体内模型考察β3肾上腺素能受体在痛觉过敏中的作用。结果显示，NA通过β3肾上腺素能受体、Gs蛋白及蛋白激酶A（PKA）激活刺激DRG神经元释放ATP，进而引起痛觉过敏。该结果揭示了与DRG去甲肾上腺素能传递相关的神经病理性疼痛新调控通路。
英文摘要
Noradrenaline (NA), released in association with sympathetic nerve sprouting into the dorsal root ganglion (DRG) after peripheral nerve injury, may enhance neuropathic pain. ATP serves as a pain mediator; however, NA-regulated ATP mobilizations in the DRG is far from understanding. In the present study, we analyzed ATP mobilizations in acutely dissociated rat DRG neurons by recording single-channel currents through P2X receptor channels as an ATP biosensor in an outside-out patch-clamp configuration and by monitoring real-time enzymatic NADPH fluorescent imaging, and examined the role for beta(3) adrenoceptors in allodynia using an in vivo rat model. We show here that NA stimulates ATP release from DRG neurons as mediated via beta(3) adrenoceptors linked to G(s) protein involving PKA activation, to cause allodynia. This represents a fresh regulatory pathway for neuropathic pain relevant to noradrenergic transmission in the DRG.