组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori）靶DNA序列（25-mer）；样品基质：缓冲液/溶液（未涉及实际临床样品）
检测原理
识别探针含10-23 DNAzyme催化基序，其5′端与靶DNA部分互补。靶DNA加入后，识别探针与靶DNA杂交，使两者末端靠近，促进与发夹底物互补区协同杂交，形成完整DNAzyme结构，其中靶DNA和识别探针分别作为两个结合臂，发夹底物为底物。在Mg2+存在下，DNAzyme催化切割发夹底物中的嘌呤–嘧啶位点，释放生物素化单链信号探针；由于切割后底物亲和力降低，DNAzyme可循环切割多个底物，实现信号放大。信号探针被金电极表面巯基化捕获探针捕获，SA–ALP通过生物素结合，ALP将1-萘基磷酸转化为1-萘酚，DPV检测1-萘酚氧化峰，峰电流随靶DNA浓度增加而增大。
检测灵敏度
LOD: 50 fM；检测范围: 100 fM–1 nM；线性范围: 100 fM–0.1 nM；线性回归方程: y = -43.42x - 0.6209；相关系数: 0.9931
效应效果
传感器对0.1 nM互补靶DNA的DPV峰电流为-4.849 μA，五种单碱基错配、四碱基错配和非互补序列分别为-0.6957、-1.1090、-1.7370、-2.5800、-2.0460、-0.6392、-0.6311 μA，空白-0.39 μA，可区分错配与非互补序列。1 nM靶DNA信号>6.0 μA，约为空白15倍。结果取三次平均，未报告RSD。电极经DMF、热水和冰浴再生，8次循环后0.1 nM峰电流偏移约20%，可重复使用。作者认为方法无需PCR，简便、低成本、低体积，适用于SNP检测、点突变识别和临床诊断。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：金电极（Au，2 mm直径），经氧化铝抛光、piranha和电化学活化，作为工作电极。
- 表面修饰层：巯基化捕获探针（thiolated capture probe，CCGTCAATGATCTC-(CH2)6-SH）自组装于金表面，用于捕获切割产生的信号探针。
- 识别元件：识别探针（recognition probe，TTCCAAAGGGCAGTCAGGCTAGCTACAACGACCTATGTGA），含10-23 DNAzyme催化基序，与靶DNA部分互补并参与邻近连接。
- 信号放大底物：生物素化发夹底物（biotinylated hairpin substrate，CCGTCACATAGGraUGAGATCATTGACGG-biotin），被激活的DNAzyme切割，释放生物素化信号探针。
- 信号标记物：链霉亲和素–碱性磷酸酶（SA–ALP），通过生物素–链霉亲和素结合固定于信号探针，并催化底物生成电活性产物。
- 酶底物/电活性产物前体：1-萘基磷酸（1-naphthyl phosphate），经ALP去磷酸化生成1-萘酚（1-naphthol），在DPV中氧化产生电流。
- 反应/检测缓冲：0.5 M Tris–HCl（pH 9.6）含10 mM Mg2+，提供DNAzyme催化辅因子和DPV检测环境；SA–ALP孵育液含1% BSA以降低非特异结合。
中文摘要
本文报道了一种基于邻近依赖性DNA连接反应和DNAzyme放大发夹底物信号的电化学DNA生物传感器，用于简单、灵敏、特异性地检测核酸。长链识别探针含有Mg2+依赖的10-23 DNAzyme催化基序。当靶DNA加入后，其5′端部分与识别探针互补，形成稳定双链；未结合部分作为DNAzyme的一个结合臂，使完整10-23 DNAzyme结构得以形成。该DNAzyme可切割生物素化发夹底物中的嘌呤–嘧啶切割位点，破坏发夹结构并释放两条单链核酸，其中一条带生物素，作为信号探针。巯基化捕获探针固定于金电极表面，可捕获信号探针；随后以链霉亲和素–碱性磷酸酶（SA–ALP）为报告分子，通过生物素–链霉亲和素作用结合。ALP催化1-萘基磷酸去磷酸化生成1-萘酚，用差分脉冲伏安法测定其氧化峰。结果表明，传感器对幽门螺杆菌（H. pylori）互补靶序列在100 fM至1 nM范围内呈灵敏响应，检出限为50 fM，并能区分互补序列与错配序列，具有较高灵敏度和可重复使用性。
英文摘要
This paper describes a novel electrochemical DNA sensor for the simple, sensitive and specific detection of nucleic acids based on proximity-dependent DNA ligation assays with the DNAzyme amplification of hairpin substrate signal. A long DNA strand contains the catalytic motif of Mg(2+)-dependent 10-23 DNAzyme, acting as the recognition probe. When the target DNA was introduced into the system, part of it was complementary to 5'-end of the recognition probe, resulting in the ligation of a stable duplex, the unbinded part of the target DNA was acted as one binding arm for the DNAzyme. This duplex containing a complete 10-23 DNAzyme structure could cleave the purine-pyrimidine cleavage site of the hairpin substrate, which resulted in the fragmentation of the hairpin structure and the release of two single-stranded nucleic acids, one of which was biotinylated and acted as the signal probe. An immobilized thiolated capture probe could bind with the signal probe, using biotin as a tracer in the signal probe, and streptavidin-alkaline phosphatase (SA-ALP) as reporter molecule. The activity of the immobilized enzyme was voltammetrically determined by measuring the amount of 1-naphthol generated after 5 min of enzymatic dephosphorylation of 1-naphthyl phosphate. The results revealed that the sensor showed a sensitive response to complementary target sequences of H. pylori in a concentration range from 100 fM to 1 nM, with a detection limit of 50 fM. In addition, the sensing system could discriminate the complementary sequence from mismatched sequences, with high sensitivity and reusability.