组成图示
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传感器类型
其他（适配体-PCR/qPCR多重蛋白传感器）
检测对象
凝血酶（thrombin）、血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）；样品基质：缓冲液、胎牛血清（FBS）、人血清
检测原理
在结合缓冲液中，目标蛋白同时与生物素化捕获适配体和带分子条形码的传感适配体结合，形成夹心复合物。捕获适配体经生物素-链霉亲和素作用固定在磁珠上，磁分离和洗涤去除未结合组分。95°C洗脱释放传感适配体，其携带的MB条形码可作为PCR模板。蛋白浓度越高，被保留并洗脱的传感适配体越多，PCR模板量越大，qPCR的Ct值越低或电泳条带越强。PCR提供指数级核酸放大，MB序列和特异性引物实现凝血酶与PDGF-BB的多重区分。
检测灵敏度
LOD: 333 pM（thrombin，multiplex）；LOD: 3.3 nM（PDGF-BB，multiplex）；单蛋白灵敏度: 1 nM（thrombin）、10 nM（PDGF-BB）；线性范围: 333 pM–333 nM（multiplex）；动态范围: at least a two order-of-magnitude dynamic range（single-protein）；最大信噪比: ∼23,000 (2(25.4 − 10.9))（thrombin）、∼84 (2(19.3 − 12.9))（PDGF-BB）
效应效果
该方法在缓冲液和未稀释胎牛血清/人血清中均可低纳摩尔水平检测两种蛋白。对333 nM的触珠蛋白、纤维蛋白原、C反应蛋白和溶菌酶均无信号，显示良好选择性；在500 nM竞争蛋白存在下交叉反应很小，多重信号与单蛋白检测基本一致。凝血酶多重结果与单重结果吻合良好，PDGF-BB多重结果较单重低估约2倍。动态范围比一种荧光法高一个数量级，灵敏度接近毛细管电泳法，但不及ELISA。作者认为其适合并行蛋白分析并可按目标蛋白定制。
传感器的构成
- 分离/捕获基底：链霉亲和素包被磁珠（streptavidin-coated magnetic beads, Dynal/Invitrogen），提供生物素-链霉亲和素固定平台并用于磁分离。
- 捕获连接层：3′-生物素-oligo(dT)间隔序列（Bio-T/Bio-P 3′-Bio），将捕获适配体连接至磁珠。
- 捕获识别元件：生物素化捕获适配体（Bio-T、Bio-P），结合凝血酶/PDGF-BB 表位并固定复合物。
- 传感识别元件：带分子条形码的传感适配体（MB-T、MB-P），结合蛋白另一表位并作为PCR模板。
- 信号标记物：分子条形码序列（MB1/MB2，MB-T 91 nt、MB-P 106 nt），用于多重PCR/qPCR区分不同蛋白。
- 信号放大体系：通用引物（U5′p/U3′p）或适配体特异性引物（T5′p/T3′p、P5′p/P3′p）与 iQ Supermix/iQ SYBR Green Supermix，用于扩增和定量。
- 结合/洗涤缓冲体系：结合缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM NaCl、1 mM MgCl2、0.1% BSA、5 μg/mL poly(dI-dC)）和洗涤缓冲液（加0.02% Tween 20），维持结合并抑制非特异结合。
- 读出系统：qPCR仪和电泳凝胶成像系统（Molecular Imager ChemiDoc XRS），通过Ct值或凝胶条带输出信号。
中文摘要
并行蛋白生物传感器对于系统研究复杂生物过程和临床诊断具有重要意义，相比单蛋白分析可提供更丰富的信息。亲和技术若正确实施，可在灵敏度和灵活性方面提供独特优势，而适配体正日益成为蛋白生物传感中常用的亲和识别试剂。本文报道了一种基于双适配体识别的溶液相多重蛋白检测方法及其表征。该方法利用两个针对不同表位的适配体识别同一目标蛋白：生物素化捕获适配体将蛋白固定于链霉亲和素磁珠，带分子条形码的传感适配体则作为可扩增信号模板。经磁分离、洗涤和洗脱后，通过多重PCR/qPCR对传感适配体进行定量，从而间接测定蛋白浓度。结果表明，该方法在缓冲液和血清样品中均可同时、定量检测凝血酶和血小板衍生生长因子-BB，并具有较高的特异性。
英文摘要
Parallel biosensors for proteins are becoming more essential for the thorough and systematic investigation of complex biological processes. These tools also enable improved clinical diagnoses relative to single-protein analyses due to their greater information content. If implemented correctly, affinity-based techniques can provide unique advantages in terms of sensitivity and flexibility. Aptamers are increasingly being used as the affinity reagents of choice for protein biosensing applications. Here, we describe the development and characterization of an aptamer-based method for parallel protein analyses that relies on recognition of the target protein by two unique aptamers targeting different epitopes on the protein. Our results show that the technique achieved simultaneous and quantitative detection of thrombin and platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) with high specificity both in buffered solutions and in serum samples.