组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
目标 DNA（target DNA，互补序列 T1）；选择性对照包括单碱基错配 DNA（one-base mismatch DNA, T2）和非互补 DNA（non-complementary DNA, T3）；样品基质为 DNA 溶液/切口内切酶缓冲液（未涉及血清、尿液等实际生物样品）。
检测原理
发夹捕获探针（HP）通过 5′端巯基固定于金电极，3′端二茂铁（Fc）作为氧化还原标签。无目标时，HP 保持茎环构象，Fc 靠近电极，DPV 产生强峰电流。完全匹配目标 DNA 杂交后，HP 环区与目标链共同形成 N.BstNB I 完整识别序列（5′-GAGTC-3′），切口内切酶结合并切割单链，使 Fc 标记片段从电极解离，峰电流下降。切割后目标 DNA 与 HP 亲和力降低而释放，可再次杂交另一 HP 并触发新一轮切割，形成切口内切酶辅助电流变化放大（NEACA）。目标浓度越高，被切割 HP 越多，Fc 电流下降越大；单碱基错配破坏酶切偶联，信号变化小，从而实现高选择性。
检测灵敏度
LOD: 0.068 fM；线性范围: 0.1–1.0 fM
效应效果
该传感器对互补目标 DNA（T1）响应强，1 pM 目标在加入 N.BstNB I 后约 30 min 内 Fc 电流降至近零；10 fM 目标与 10 U 酶反应 30 min 可切割约 100% HP。选择性方面，单碱基错配 DNA（T2）仅引起轻微电流下降，非互补 DNA（T3）无显著变化，表明对单碱基错配具有良好判别能力。重现性方面，0.5 fM 目标 8 次重复测定 RSD 为 5.8%。与无切口内切酶的杂交法相比，1 pM 目标在 60 min 内仅部分信号损失且低于检测限，而 NEACA 可立即检测并使电流近零，灵敏度优于多种基于构象变化的电化学 DNA 传感器。作者认为其制备简单、操作方便，有望用于 SNP 分析和基因分型，并可发展便携式低成本 DNA 检测设备。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：金电极（GE），提供导电基底与电子转移动力学，并通过 S–Au 键固定探针。
- 识别元件：发夹捕获探针（HP），5′端巯基用于固定，3′端二茂铁（Fc）标记，环区嵌入 N.BstNB I 识别序列，负责与目标 DNA 杂交并形成酶切位点。
- 信号标记物：二茂铁（Fc），作为电化学氧化还原标签，其峰电流反映探针与电极距离及切割程度。
- 封闭剂：2-巯基乙醇（MCH），与 HP 形成混合单分子层（HP/MCH/GE），阻止内切酶非特异吸附并置换弱吸附探针。
- 混合单分子层：HP/MCH/GE，由 HP 与 MCH 在金电极表面形成，提供有序界面并减少非特异吸附。
- 识别/放大元件：切口内切酶 N.BstNB I，识别 5′-GAGTC-3′ 并切割单链，触发 HP 切割与目标 DNA 循环释放，实现电流变化放大。
中文摘要
本文报道一种基于切口内切酶辅助电流变化放大（NEACA）的电化学 DNA 生物传感器，用于序列特异性检测目标 DNA。传感器以金电极为基底，5′端巯基、3′端二茂铁（Fc）标记的发夹捕获探针（HP）通过硫-金键固定，并用2-巯基乙醇（MCH）封闭形成混合单分子层。发夹环区嵌入 N.BstNB I 切口内切酶识别序列。无目标时发夹构象使 Fc 靠近电极，产生强氧化还原电流；完全匹配目标 DNA 杂交后形成完整识别位点，N.BstNB I 结合并切割 HP，使 Fc 片段脱离电极，目标 DNA 释放后可循环杂交并触发多轮切割，导致 Fc 峰电流显著下降至近零。该传感器对互补目标 DNA 的检出限为 0.068 fM，线性范围为 0.1–1.0 fM，且对单碱基错配具有良好判别能力，有望用于 SNP 分析和基因分型。
英文摘要
Based on the "nicking endonuclease assisted" detection strategy, a novel electrochemical biosensor for the sequence-specific detection of DNA with ultrahigh sensitivity and selectivity is developed. By employing the above strategy, this DNA biosensor can detect as low as 0.068 fM target DNA and exhibits high discrimination ability even against a single-base mismatch.