组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
靶DNA S3（33-mer DNA target S3）、靶DNA S4（33-mer DNA target S4）；样品基质为 Tris–HCl 缓冲液（pH 7.0）
检测原理
两种氨基捕获探针 S1/S2 经 EDC/NHS 共价固定于 GCE，分别与靶 DNA S3/S4 杂交形成双链。AuNPs 表面通过硫-金键固定巯基报告 DNA S5/S6 和生物素-巯基信号 DNA S7；报告 DNA 与靶 DNA 互补，实现夹心杂交，将 AuNP-酶偶联物锚定到电极。Avidin-HRP/ALP 通过生物素-亲和素结合到 S7。HRP 催化 OAP 和 H2O2 生成电活性 AP，ALP 催化 DPP 生成苯酚；DPV 分别检测 AP 和苯酚氧化峰。AuNPs 携带多个酶分子，增加每次杂交的酶量，实现信号放大。靶浓度越高，结合 AuNP-酶越多，酶催化产物越多，DPV 峰电流越大。
检测灵敏度
HRP-AuNP: LOD: 1.0 × 10−13 M；线性范围: 1.5 × 10−13–5.0 × 10−12 M；回归方程: y = 0.0515x + 0.4018（x 单位 10−13 M，y 单位 μA）；斜率: 0.0515；R^2 = 0.9951。ALP-AuNP: LOD: 1.2 × 10−11 M；线性范围: 4.5 × 10−11–1.0 × 10−9 M；回归方程: y = 0.0511x + 0.1198（x 单位 10−11 M，y 单位 μA）；斜率: 0.0511；R^2 = 0.9969。
效应效果
该传感器对完全互补 DNA 产生明显 DPV 响应，非互补序列和单碱基错配序列均无峰电流增强，显示较高选择性。酶-AuNP 标签相比单个酶标签，HRP 和 ALP 催化电流分别提高约 1.8 倍和 1.7 倍，证实 AuNPs 载体带来信号放大。空白标准偏差为 1.7%（HRP）和 2.0%（ALP，n=11），重现性较好。文中未报告实际样品回收率、长期稳定性或与 ELISA/HPLC/qPCR 的直接对比，仅指出检出限与已有 HRP/ALP 催化电化学 DNA 检测相当。作者认为该策略可用于多重 DNA 检测，并可扩展至抗原-抗体等生物传感体系。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：玻碳电极（GCE），工作电极，经 EDC/NHS 活化用于共价固定氨基捕获 DNA
- 识别元件：氨基修饰捕获探针 DNA（S1、S2），分别捕获靶 DNA S3 和 S4
- 靶结合层：靶 DNA（S3、S4），与捕获探针杂交形成双链 DNA
- 信号标记/放大元件：金纳米颗粒（AuNPs），柠檬酸还原 HAuCl4 制备，约 13 nm，作为酶和 DNA 载体
- 识别/信号 DNA：巯基报告 DNA（S5、S6）与靶 DNA 互补；生物素-巯基信号 DNA（S7）用于连接亲和素-酶
- 酶标记物：亲和素-HRP（Avidin-HRP）和亲和素-ALP（Avidin-ALP），通过生物素-亲和素结合催化底物
- 底物/信号生成物：邻苯二酚胺（OAP）和 H2O2 经 HRP 生成 AP；磷酸苯二钠（DPP）经 ALP 生成苯酚
- 读出层：CHI 660C 伏安分析仪，DPV 检测 AP 和苯酚氧化峰
中文摘要
本文提出一种基于酶功能化金纳米颗粒（AuNPs）作为催化标签的多重电化学 DNA 传感器，可在同一样品中同时检测两条 DNA 靶序列。该传感器采用夹心检测策略：两种捕获探针 DNA 共价固定在玻碳电极（GCE）表面，与靶 DNA 杂交后，再与负载于 AuNPs 上的报告 DNA 杂交。AuNP 表面同时连接两种 DNA 序列，一种与靶 DNA 互补，另一种非互补序列分别通过生物素-亲和素作用连接辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）。AuNPs 作为载体可增加每次杂交结合的酶分子数量，从而提高检测灵敏度。HRP 催化邻苯二酚胺和过氧化氢生成 1,2-氨基苯并噁嗪-3-酮（AP），ALP 催化磷酸苯二钠生成苯酚，差分脉冲伏安法（DPV）检测电活性产物。最优条件下，HRP-AuNP 标签对 33 碱基序列的线性范围为 1.5×10−13 至 5.0×10−12 M，检出限为 1.0×10−13 M；ALP-AuNP 标签线性范围为 4.5×10−11 至 1.0×10−9 M，检出限为 1.2×10−11 M。
英文摘要
Multiplex electrochemical detection of two DNA target sequences in one sample using enzyme-functionalized Au nanoparticles (AuNPs) as catalytic labels for was proposed. This DNA sensor was fabricated using a "sandwich" detection strategy, involving two kinds of capture probes DNA immobilized on glassy carbon electrode (GCE), and hybridization with target DNA sequences, which further hybridized with the reporter DNA loaded on the AuNPs. The AuNP contained two kinds of DNA sequences, one was complementary to the target DNA, while the other was noncomplementary to the target. The noncomplementary sequences were linked with horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase (ALP), respectively. Enhanced detection sensitivity was obtained where the AuNPs carriers increased the amount of enzyme molecules per hybridization. Electrochemical signals were generated from the enzymatic products produced from the substrates catalyzed by HRP and ALP. Under optimal conditions, a 33-mer sequence could be quantified over the ranges from 1.5x10(-13) to 5.0x10(-12) M with a detection limit of 1.0x10(-13) M using HRP-AuNP as labels, and a 33-mer sequence could be quantified over the ranges from 4.5x10(-11) M to 1.0x10(-9) M with a detection limit of 1.2x10(-11) M using ALP-AuNP as labels.