组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）；样品基质：5 mM pH 7.0 磷酸盐缓冲液；另评估乙酰胆碱酯酶抑制剂（edrophonium chloride, EC、pyridostigmine bromide, PB）
检测原理
该传感器以 AChE 为识别元件，以 CPO 为 pH 敏感荧光指示剂。ACh 进入 TEOS/CHIT 基质后，被 AChE 催化水解为胆碱和乙酸；乙酸进一步解离释放 H+，使酶微环境局部 pH 下降。CPO 的质子化/去质子化状态随 pH 改变，导致荧光强度降低和发射峰蓝移（约 545 nm 至 530 nm）。ACh 浓度越高，单位时间内产生的 H+ 越多，CPO 荧光猝灭越强，I0/I 信号越大。TEOS/CHIT 溶胶-凝胶/壳聚糖网络通过氢键和孔道结构保持 AChE 活性并限制组分泄漏，酶催化反应本身提供化学放大。系统采用 460 nm 激发、540 nm 发射，由 CCD 成像读取荧光强度，实现 ACh 的定量检测。
检测灵敏度
LOD: 0.27×10−8 M；线性范围: 1×10−8–1×10−6 M 和 1×10−6–1.2×10−5 M
效应效果
阵列在 30×10−7 M ACh 下连续 6 次测量，RSD=3.27%，重复性良好；CPO 在 TEOS/CHIT 基质中经 1 h 荧光监测显示良好光稳定性。pH 7.0 和 5 mM 磷酸盐缓冲液为最佳条件，3 min 响应最大。对 10−4 M 依酚氯铵（EC）和溴吡斯的明（PB）的抑制实验中，CPO 发射强度分别较 ACh 对照降低 11% 和 12%，表明该阵列可用于评估 AChE 抑制剂。论文未报告实际样品加标回收率，也未与 ELISA、HPLC 或 qPCR 等方法进行直接对比。作者认为该光学阵列简单、灵敏、准确、低成本，适合微型化，并计划进一步集成到微流控系统中。
传感器的构成
- 基底：玻璃载玻片（microscope slides），承载点样阵列。
- 溶胶-凝胶/壳聚糖基质：正硅酸乙酯（TEOS）/壳聚糖（CHIT）网络，掺杂 AChE 与 CPO，提供多孔微环境并保持酶活性。
- 识别元件：乙酰胆碱酯酶（AChE），催化乙酰胆碱（ACh）水解。
- 信号指示剂：pH 敏感荧光探针 2-苯基-4-[4-(1,4,7,10-四氧杂-13-氮杂环十五烷基)亚苄基]噁唑-5-酮（CPO），随 pH 下降发生荧光猝灭和蓝移。
- 固定剂：戊二醛（glutaraldehyde），点样干燥后处理 2 min，用于交联固定酶/基质。
- 读出系统：Sensovation 荧光读取系统，460 nm 激发、540 nm 发射，CCD 成像读取荧光强度。
中文摘要
本研究开发了一种高灵敏度荧光酶阵列，用于乙酰胆碱（ACh）的定量检测。阵列通过微点样将 pH 敏感荧光探针 2-苯基-4-[4-(1,4,7,10-四氧杂-13-氮杂环十五烷基)亚苄基]噁唑-5-酮（CPO）与乙酰胆碱酯酶（AChE）共同掺杂于正硅酸乙酯/壳聚糖（TEOS/CHIT）溶胶-凝胶基质中，并点样于玻璃载玻片。TEOS/CHIT 网络为酶提供保持生物活性的微环境，并防止酶泄漏。研究考察了阵列的最佳工作条件，包括 pH、离子强度和响应时间。在 pH 7.0、5 mM 磷酸盐缓冲液中，AChE 催化 ACh 水解产生乙酸，使局部 pH 下降，引起 CPO 荧光猝灭和发射蓝移，通过 460 nm 激发、540 nm 发射读取信号。阵列对 ACh 的响应重复性好，RSD=3.27%（n=6），在 1×10−8–1×10−6 M 和 1×10−6–1.2×10−5 M 范围内呈线性，检出限为 0.27×10−8 M。该阵列结构简单、成本低，可用于 ACh 及 AChE 抑制剂检测。
英文摘要
A highly sensitive fluorescent enzyme array for quantitative acetylcholine detection is developed. The enzyme array has been constructed by spotting of pH sensitive fluorophore 2-phenyl-4-[4-(1,4,7,10-tetraoxa-13-azacycloopentadecyl)benzylidene]oxazol-5-one and acetylcholinesterase doped in tetraethoxysilane/chitosan matrix via a microarrayer. The constructed tetraethoxysilane/chitosan network provided a microenvironment in which the enzyme molecule was active biologically. The optimal operational conditions for the array developed were investigated. The response of the developed biosensor array to acetylcholine was highly reproducible (RSD = 3.27%, n = 6). A good linearity was observed for acetylcholine in the concentrations up to 1 × 10(-8) M, with a detection limit of 0.27 × 10(-8) M.