组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
环磷酸鸟苷（cGMP，guanosine 3′,5′-cyclic monophosphate）、乙酰化cGMP（acetylated cGMP）；样品基质为20 mM Tris缓冲液及大鼠主动脉平滑肌细胞A7r5裂解上清。
检测原理
抗cGMP抗血清通过半胱胺自组装层和NHS/EDC共价固定于金纳米粒子修饰光纤表面。当cGMP或乙酰化cGMP与抗血清结合时，金纳米粒子周围局部折射率升高，导致635 nm激光激发的局域表面等离子共振（LSPR）吸收发生变化，反射光强度降低。系统以I/I0表示响应，无需标记、洗涤或放射性示踪。由于所用抗血清由cGMP-BSA偶联物制备，乙酰化cGMP与抗体亲和力更高，因此信号更强。
检测灵敏度
LOD: 0.1 pmol/ml（cGMP）；LOD: 1 fmol/ml（acetylated cGMP）；检测范围: 0.1–100 pmol/ml（cGMP）、0.0025–0.1 pmol/ml（acetylated cGMP）；双倒数拟合斜率: 42.46±0.62 pmol/ml、326±35 pmol/ml（cGMP）、20.51±0.36 pmol/ml（acetylated cGMP）；Kd: 0.526 pmol/ml、14.8 pmol/ml（cGMP）、0.0047 pmol/ml（acetylated cGMP）
效应效果
该传感器对cGMP的检测范围为0.1–100 pmol/ml，比EIA更宽；对乙酰化cGMP的灵敏度比cGMP高约三个数量级。用精胺NONOate和氧合血红蛋白刺激大鼠A7r5平滑肌细胞后，15、30和60 min时传感器测得的胞内cGMP浓度与EIA结果相似，验证了实际样品适用性。4 ℃保存1周后对50 pmol/ml cGMP的响应下降约25%，保存4周下降约50%，但剩余活性达50%时仍可使用。方法无标记、无洗涤、背景低，并可测定抗体-抗原解离常数。
传感器的构成
- 基底/换能器：多模塑料包层石英光纤（F-MBC），传导光并作为反射式光纤传感基底
- 反射层：银膜（Ag film）涂覆于无包层端，反射光并增强信号收集
- 纳米材料修饰层：金纳米粒子（Au NPs）修饰光纤，产生局域表面等离子共振（LSPR）吸收
- 氨基自组装层：半胱胺二盐酸盐（cystamine）自组装单层，提供氨基用于抗体偶联
- 交联偶联层：N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）/1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）混合液，连接抗体羧基与氨基
- 识别元件：抗cGMP抗血清（anti-cGMP antiserum），特异性结合cGMP或乙酰化cGMP
- 封闭/稳定剂：0.1% 牛血清白蛋白（BSA）存在于抗血清缓冲液中，降低非特异结合并稳定抗体
中文摘要
鸟苷三磷酸（GTP）经可溶性或颗粒型鸟苷酸环化酶（GC）生成环磷酸鸟苷（cGMP），是细胞内重要的第二信使。现有cGMP测定方法如放射免疫分析（RIA）和酶免疫分析（EIA）需使用放射性同位素或示踪剂。为建立无标记、无放射性、可直接检测且高特异高灵敏的cGMP检测方法，作者将抗cGMP抗血清偶联到金纳米粒子修饰光纤（GNOF）上，基于局域表面等离子共振（LSPR）测定cGMP浓度。制备探针的最佳抗血清稀释度为1:250，孵育时间为2 h。该传感器对乙酰化cGMP和cGMP的检测范围分别为0.0025–0.1 pmol/ml和0.1–100 pmol/ml；测定乙酰化cGMP的灵敏度比cGMP高约三个数量级。传感器在4 ℃保存4周内灵敏度未明显下降。
英文摘要
Guanosine 3',5'-cyclic monophosphate (cGMP) produced from guanosine triphosphate (GTP) via soluble or particulate guanylyl cyclase (GC) is an important second messenger for signal transduction within cells. The currently used methods of measuring cGMP including radioimmunoassay and enzyme immunoassay involve the use of radioisotopes or tracers. To develop a cGMP assay that is label-free, non-radioactive, able to detect cGMP directly, and highly specific and sensitive, we used a gold nanoparticle-modified optical fiber (GNOF) conjugated with anti-cGMP antiserum to determine cGMP concentration based on localized surface plasmon resonance (LSPR). The optimal antisera dilution and incubation time for preparing the probe are 1:250 and 2 h, respectively. The sensor shows detection ranges of 0.0025-0.1 and 0.1-100 pmol/ml for acetylated cGMP and cGMP, respectively. The sensitivity for measuring acetylated cGMP is three orders of magnitude higher than that for cGMP. In addition, the biosensor can be stored at 4°C up to 4 week without losing sensitivity significantly.