组成图示
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传感器类型
侧流层析试纸条
检测对象
凝血因子V Leiden突变（FV G1691A/FVL）、凝血酶原FII G20210A突变、MTHFR C677T突变；样品基质为临床血液样本提取的基因组DNA
检测原理
检测以三重复PCR扩增FV、FII和MTHFR目标片段开始。随后进行等位基因特异性引物延伸（PEXT）：正常引物5'端标记生物素，突变引物5'端标记荧光素，只有3'端与模板完全互补时Vent(exo-) DNA聚合酶才延伸。延伸段与带poly(dA)尾的寡核苷酸探针杂交，形成可被试纸条捕获的复合物。试纸条结合垫上干燥的AuNP-poly(dT)与探针poly(dA)杂交，将标记产物连接到金纳米颗粒。缓冲液毛细迁移使复合物到达T1和T2区，T1链霉亲和素捕获生物素标记正常产物，T2抗FITC抗体捕获荧光素标记突变产物，金颗粒积累形成红线；CZ poly(dA)捕获多余金颗粒作为质控。信号随对应等位基因延伸产物存在与否及相对量变化，实现视觉基因分型。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该面板在40例临床基因组DNA样本中对FV、FII和MTHFR三种突变进行基因分型，结果与RFLP分析及测序完全一致，表明选择性良好。试纸条重现性约为8%（测试区密度信号变异系数）。加速老化试验中，试纸条在36°C保存10 d（相当于室温1年）后信号仅轻微下降，显示稳定性可接受。优化显示Mg2+在0.8–2.0 mM范围内不影响等位基因判别，PEXT引物0.1 μM、探针0.13 μM时信号最佳；AuNP超过6 fmol或anti-FITC超过250 ng/4 mm会出现非特异信号，降低突变引物至0.02 μM可消除。PCR后总检测时间约20 min，试纸条15 min内视觉判读，无需仪器和昂贵试剂，适合小型实验室和即时检测。
传感器的构成
- 试纸条基底：塑料背衬及吸水垫、玻璃纤维结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫，支撑层析
- 结合垫：玻璃纤维结合垫负载干燥AuNPs（40 nm）-poly(dT)30，作为信号标记物
- 检测区T1：硝酸纤维素膜固定链霉亲和素（streptavidin），捕获生物素标记正常等位基因产物
- 检测区T2：硝酸纤维素膜固定抗FITC抗体（anti-FITC），捕获荧光素标记突变等位基因产物
- 质控区CZ：硝酸纤维素膜固定poly(dA)30，捕获多余AuNP-poly(dT)
- 识别元件：等位基因特异性PEXT引物（N/M primers）5'标记生物素或FITC，识别正常/突变等位基因
- 杂交探针：互补延伸段的oligo probe，3'带poly(dA)尾，连接PEXT产物与AuNP-poly(dT)
- 层析缓冲液：10 mM PBS、4% glycerol、1% SDS，驱动毛细迁移与杂交
中文摘要
本研究开发了一种快速、低成本的三联生物传感器面板，用于血栓形成倾向最常见三种遗传风险因素的视觉基因分型，即凝血因子V Leiden（FV G1691A）、凝血酶原FII G20210A和MTHFR C677T单核苷酸突变。方法采用三重复PCR同时扩增三个目标片段，随后对每个位点进行5 min引物延伸反应进行等位基因判别。延伸产物通过双等位基因试纸条型DNA生物传感器检测：等位基因特异性引物分别以生物素或荧光素标记，延伸段与带poly(dA)尾的探针杂交，再与结合垫上干燥的金纳米颗粒-poly(dT)偶联物杂交，经毛细迁移至固定链霉亲和素和抗FITC抗体的测试区，形成肉眼可见红线。该传感器一次性使用，无需专用仪器或昂贵试剂，15 min内完成检测。40例临床样本基因分型结果与RFLP和测序完全一致。
英文摘要
We developed a rapid and low-cost panel of three assays for visual genotyping of the three most common genetic risk factors in thrombophilia, namely, the single-point mutations in the FV (Leiden factor), FII and MTHFR genes. A triplex PCR was developed for simultaneous amplification of three fragments spanning the interrogated loci. Allele discrimination was accomplished by a 5-min primer extension reaction on each locus. Detection of the extension products was performed by means of a dual-allele dipstick-type DNA biosensor. The biosensor is disposable and allows visual detection and confirmation of the genotyping products within 15 min by hybridization without the need for specialized instruments or expensive reagents. The proposed method was evaluated by genotyping 40 samples with a variety of genotypes for all three mutations. The genotyping results were in full concordance with those obtained by restriction fragment length polymorphism analysis and sequencing.