Fluorescence resonance energy transfer biosensors for cancer detection and evaluation of drug efficacy.

荧光生物传感器

BCR-ABL 激酶活性（BCR-ABL kinase activity）；样品基质：活细胞（细胞系、原代细胞、活检样本）

该传感器基于荧光共振能量转移（FRET）原理。BCR-ABL 激酶作为被测物，磷酸化 CrkL 识别肽上的酪氨酸 Y207；磷酸化酪氨酸随后与同一分子内的 SH2 域结合，使 CrkL 发生分子内构象变化，改变供体 ECFP 与受体 Venus 之间的距离和取向。当 ECFP 被激发时，能量通过非辐射偶极耦合转移至 Venus，FRET 效率随构象变化而升高，表现为 FRET 比值增加。药物抑制 BCR-ABL 活性会降低磷酸化水平，从而降低 FRET 信号。作者通过截短 CrkL C 端、环状置换 ECFP 和单体化 Venus 提高信噪比，使 FRET 比值变化更明显。FRET 信号对荧光蛋白浓度和激发光强不敏感，因此可在活细胞中定量反映激酶活性。

FRET ratio 增加: 80%；imatinib 可检测浓度: 0.1 μmol/L；western blotting 检测阈值: 0.5 μmol/L；antibody staining 检测阈值: 1 μmol/L

该 FRET 生物传感器对 BCR-ABL 具有良好特异性，作者通过激酶阵列筛选验证其选择性，并利用 Y207 及 SH2 域突变确认 FRET 变化来源于设计的分子内磷酸化酪氨酸-SH2 结合。在药物检测方面，传感器可识别伊马替尼在 0.1 μmol/L 浓度下的抑制作用，而 Western blotting 和抗体染色分别需 0.5 μmol/L 和 1 μmol/L 才能检测到，灵敏度明显更高。研究还证实二代抑制剂 nilotinib 和 dasatinib 的效力强于 imatinib。结合流式细胞术，该传感器可在大量细胞中检测少量耐药癌细胞，适用于活检样本评估、耐药预测和个体化治疗选择。文中未报告稳定性、RSD 或加标回收率。

Mizutani 等开发了一种高灵敏、高特异的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器，用于在活细胞中定量检测 BCR-ABL 激酶活性及其对药物的响应。该传感器以 BCR-ABL 主要底物 CrkL 为识别元件，将其夹在黄色荧光蛋白 Venus 与增强青色荧光蛋白 ECFP 之间；当 BCR-ABL 激酶活性升高时，CrkL 酪氨酸位点被磷酸化，并与分子内 SH2 域结合，引起构象变化，使 FRET 信号增强。作者通过截短 CrkL C 端、环状置换供体 ECFP 和单体化受体 Venus 提高灵敏度，最终命名为 Pickles 的传感器在体外经 BCR-ABL 刺激后 FRET 比值升高约 80%。激酶阵列筛选和关键位点突变验证了其特异性。该传感器可检测伊马替尼在 0.1 μmol/L 的抑制作用，优于 Western blot 和抗体染色方法，并能结合流式细胞术识别细胞群中少量耐药癌细胞，为癌症检测、药物疗效评估和耐药预测提供工具。