组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
超氧阴离子自由基（superoxide anion radical, O2•−）、亚硝酸根（nitrite, NO2−）；样品基质：0.1 M PBS体外溶液、LPS刺激的MCF-7乳腺癌细胞培养体系/细胞释放物
检测原理
该传感器利用SOD1的双重酶活性实现双信号电化学检测。O2•−进入SOD1狭窄活性通道后，与Cu(I/II)中心发生循环氧化还原并被歧化为O2和H2O2，使SOD1自身氧化还原峰（约+0.1 V阳极峰和−0.035 V阴极峰）电流增强；NO2−则在SOD1催化下发生阳极氧化生成NO3−，在约+0.68 V产生不可逆阳极峰。CNT/PPy纳米复合层提供高导电微孔通道，促进SOD1活性中心与Pt电极间的直接电子转移，提高酶负载和电流响应。通过循环伏安或安培法读取峰电流，电流随O2•−或NO2−浓度增加而线性增大，从而实现两者的同步定量。
检测灵敏度
O2•−: LOD: 0.1 ± 0.03 μM；线性范围: 0.1–750 μM；灵敏度: 0.19 ± 0.003 μA μM−1 cm−2；R^2 = 0.9948。NO2−: LOD: 0.5 ± 0.025 μM；线性范围: 0.5–2000 μM；灵敏度: 0.2 ± 0.002 μA μM−1 cm−2。
效应效果
该传感器选择性来自SOD1对O2•−的高特异性及窄活性通道；外源加入5 μM SOD1可使O2•−峰电流下降95%，证明响应源于酶催化。CNT/PPy使O2•−安培响应较无CNT提高4倍，NO2−阳极电流提高5倍。重现性RSD分别为O2•− 3.8%、NO2− 3.2%；连续30天响应稳定。与文献报道的O2•−和NO2−修饰电极相比，检出限和灵敏度更优。在LPS刺激MCF-7乳腺癌细胞中，48 h测得O2•− 0.1±0.02 μM、NO2− 4.2±0.015 μM，与参考文献方法一致，可用于体外和细胞培养体系实时同步监测。
传感器的构成
- 基底/工作电极：Pt电极（直径0.5 mm），作为换能器提供电子传导与电化学界面
- 导电聚合物修饰层：聚吡咯（PPy），由0.4 M吡咯/0.1 M KCl电聚合10圈形成微孔导电基质，增大表面积并固定酶
- 纳米材料修饰层：单壁碳纳米管（CNT）/Nafion，滴涂25 μL CNT-Nafion乙醇溶液，增强导电性、促进SOD1直接电子转移并减少污损
- 识别/催化元件：牛红细胞Cu,Zn超氧化物歧化酶（SOD1），5 μL 0.2 g/mL，催化O2•−歧化和NO2−氧化
- 交联固定剂：戊二醛（GA），2.5%溶液5 μL，交联固定SOD1并稳定在CNT/PPy中
- 检测介质：0.1 M PBS（pH 7.0）含100 μM DTPA，提供反应缓冲环境
- 三电极体系：Ag/AgCl参比电极和Pt丝对电极，配合CHI 2000A完成电化学测量
中文摘要
本文报道了一种新型高灵敏电化学生物传感器，用于直接同时测定超氧阴离子自由基（O2•−）和亚硝酸根（NO2−）。该传感器以铂（Pt）电极为基底，在其表面电聚合聚吡咯（PPy），并将溶解于Nafion中的碳纳米管（CNT）引入PPy基质，形成CNT/PPy纳米复合修饰层，随后用戊二醛交联固定牛红细胞Cu,Zn超氧化物歧化酶（SOD1）。CNT/PPy纳米复合层增强了SOD1的负载量，促进SOD1与电极间的直接电子转移，并降低污损效应。扫描电镜显示PPy和CNT/PPy在Pt电极上具有高度微孔结构。循环伏安法表明，SOD1固定电极呈现准可逆氧化还原峰，形式电位为+0.065 V（vs. Ag/AgCl）。该传感器对O2•−在0.1–750 μM范围内线性响应，检出限为0.1±0.03 μM；对NO2−在0.5–2000 μM范围内线性响应，检出限为0.5±0.025 μM。此外，传感器具有高灵敏度、良好重现性，并在30天内保持稳定性，不仅能分别检测O2•−和NO2−，还可用于体外及癌细胞中两者的同步测定。
英文摘要
A novel highly sensitive biosensor for the direct and simultaneous determination of superoxide anion radical (O2-) and nitrite (NO2-) was developed by incorporation of carbon nanotube (CNT) solubilized in nafion in polypyrrole (PPy) matrix on Pt electrode followed by immobilization of Cu,ZnSOD (SOD1) on it. The CNT/PPy nanocomposite electrode enhanced the immobilization of SOD1 and promoted the electron transfer of SOD1 minimizing its fouling effect. The surface morphological images of PPy and CNT-PPy nanocomposite on Pt electrode were obtained by scanning electron microscopy exhibiting highly microporous structures. The electrochemical behavior of the biosensor investigated by cyclic voltammetry revealed that the SOD1 immobilized electrode showed characteristic of SOD1 quasi-reversible redox peaks with a formal potential of +0.065 V vs. Ag/AgCl. The biosensor exhibited a linear response over the concentration range from 0.1 to 750 μM, with a detection limit of 0.1±0.03 μM for O2- and a corresponding linear range of 0.5-2000 μM, with a detection limit of 0.5±0.025 μM for NO2-. In addition, the biosensor exhibited high sensitivity, good reproducibility and retained stability over 30 days. This modified electrode was quite effective not only in detecting O2- and NO2- independently but also determining the concentration of O2- and NO2- simultaneously in vitro and from cancer cells.