组成图示
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传感器类型
化学发光生物传感器
检测对象
短链 DNA（short-length DNA，如 target A、target D、target E）；样品基质为缓冲液 A（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，0.5 M NaCl）中的 DNA 溶液
检测原理
该传感器采用模板依赖的表面杂交机制。羧基磁珠经 EDC 活化后固定捕获 DNA；报告 DNA 3′ 端带生物素，其 8 nt 尾序列与捕获 DNA 互补但熔点低于 20 °C，因此无目标时二者几乎不杂交，背景低。当短链目标 DNA 与报告 DNA 互补结合后，目标-报告双链与捕获-报告尾双链在缺口处发生共轴堆叠，显著提高三元复合物的热力学稳定性，使报告 DNA 锚定到磁珠表面。随后链霉亲和素-HRP 通过生物素-亲和素作用结合到表面，催化增强化学发光 HRP 底物产生发光。目标 DNA 量越高，表面形成的三元复合物越多，CL 信号越强，从而实现定量检测。
检测灵敏度
LOD: 0.01 fmol（Table 2 中列为 0.1 pM）；线性范围: 0.1–100 fmol；灵敏度斜率: 0.6084（logI 对 logC）；R^2 = 0.9932
效应效果
在 20 °C 下，100 fmol target A 产生比空白高 16 倍的 CL 信号；温度研究显示有目标时 20 °C 信噪比最大，>40 °C 三元复合物解离。1–5 nt gap 使 CL 信号逐渐下降，非互补捕获探针无信号，证明共轴堆叠和表面杂交是信号来源。选择性方面，100 fmol 完全互补序列与 noncomplementary、C-C、C-T、C-A 及双碱基错配序列的 CL 强度比为 100:3:7.5:18.5:23.1:18.4，中心错配区分较弱。方法对 15-mer target E 和 20-mer target D 均保持 0.1–100 fmol 线性，LOD 0.01 fmol（Table 2 列 0.1 pM），作者认为可发展为短链 DNA/RNA 通用检测平台。
传感器的构成
- 基底/换能器：羧基末端磁性微球（carboxyl-terminated magnetic beads，1.5 µm，20 mg/mL），作为固相载体并提供磁分离表面
- 偶联/修饰层：EDC（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide）活化羧基，与捕获探针 3′ 端氨基（NH2）共价偶联
- 识别元件：表面固定捕获 DNA（capture A/B/C/X），含低熔点互补区（4/8/12 bp）及 10 nt 腺嘌呤间隔（A10 spacer）
- 识别/信号元件：生物素标记报告 DNA（biotinylated reporter A/B/C/E），3′ 端生物素，含目标互补序列和 8 nt 低熔点尾序列
- 信号标记物：链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP, SA-HRP），结合生物素并催化化学发光底物
- 信号底物：增强化学发光 HRP 底物（enhanced CL HRP substrate），产生可测化学发光信号
- 洗涤缓冲液：7 mM Tris-HCl（pH 8.0）、0.17 M NaCl、0.05% Tween 20，用于去除非特异结合
中文摘要
短链 DNA 和 RNA（如仅含 17–25 个核苷酸的成熟小 RNA）在基于杂交的检测中常因探针结合效率低、双链结构难以耐受洗涤而难以准确检测。本文报道一种基于模板依赖表面杂交事件的短链 DNA 检测概念验证。该策略中，捕获探针与报告探针在 20 °C 下互不杂交，但在目标模板存在时可通过形成稳定三元复合物而退火。报告探针 3′ 端带有生物素标记，并含有与磁珠固定捕获探针互补的低熔点尾序列；目标 DNA 与报告探针结合后，通过共轴堆叠增强双链稳定性，使报告探针锚定于磁珠表面，再与链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合，并用增强化学发光底物检测。通过温度梯度监测有无目标时的化学发光变化，研究了该磁珠基 DNA 生物传感器的热力学行为。结果表明，该方法可实现短链目标 DNA 的高选择性和高灵敏度检测，有望成为开发短链 DNA/RNA 简单生物传感器的通用技术。
英文摘要
Short-length DNA and RNA, such as mature small RNA, which contains only 17-25 nucleotides, are always a problem in hybridization-based detection assays. In this paper, we report a proof-of-concept for a new short-length DNA detection technology which encompasses a design strategy whereby capture and reporter probes that do not hybridize to each other at 20 degrees C can be made to anneal to each other in the presence of a template via the formation of a stable three-component complex. The thermodynamics of this magnetic bead-based DNA biosensor was then investigated in detail by monitoring chemiluminescence (CL) changes in the absence and presence of targets over a temperature profile. The data show that this new biosensor offers the possibility of highly selective and sensitive detection of the short-length target DNA. In view of these advantages, this template-dependent surface-hybridization assay, as a new CL strategy, might create a universal technology for developing simple biosensors in sensitive and selective detection of short-length DNA and RNA.