组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
核糖核酸酶H活性（Ribonuclease H, RNase H activity）、反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, AON）激活RNase H的能力；样品基质为RNS缓冲液（75 mM KCl、50 mM Tris-HCl、3 mM MgCl2、10 mM DTT、2.5%甘油，pH 8.3）中的酶/寡核苷酸溶液
检测原理
上游SPR芯片固定生物素化嵌合寡核苷酸cON，其RNA区cON-R模拟mRNA，3′DNA尾cON-D用于质量放大。AON注入后与cON-R杂交形成RNA:DNA双链，表面质量增加，SPR响应上升。加入RNase H后，酶识别并稳定RNA:DNA杂交双链，水解RNA链，使上游表面质量减少，SPR响应下降；下降幅度与RNase H活性和AON激活能力相关。释放的含cON-D片段随流路到达下游，与固定BdTG25探针杂交，下游质量增加，SPR响应上升。AON浓度影响双链形成和切割速率，温度影响双链稳定性；DNA尾通过增大切割片段质量提高信号。
检测灵敏度
—
效应效果
该双通道SPR方法无需标记AON，可实时监测RNA切割与产物捕获，参考通道补偿折射率和非特异结合。cON3较cON1切割响应提高约50%，约75% cON-R被切割，下游捕获约10%切割质量。AON 5–500 nM中>250 nM后受质量传输限制，故选100 nM；20、31、37°C切割比例为77%、43%、8%。PS1/PS2可激活RNase H，但磷酸硫酯比例升高降低激活能力。作者认为可用于AON筛选和逆转录病毒RNase H抑制剂研究。
传感器的构成
- 基底/换能器：薄金膜SPR芯片与四通道流池，通过衰减全反射激发表面等离子体，响应正比于表面生物分子质量
- 自组装单分子层：HS-C11-EG4-OCH2-COOH羧基烷硫醇与HS-C11-EG2-OH羟基烷硫醇混合SAM，提供羧基固定位点并降低非特异结合
- 连接固定层：链霉亲和素（streptavidin）通过酰胺键连接羧基SAM，用于捕获生物素化寡核苷酸探针
- 上游识别探针：生物素化嵌合寡核苷酸cON1/cON2/cON3（biotin-(TEG)2-5′-dC7-rA16-dC7、d(CCA)5、d(CCA)8dC-3′），含RNA底物cON-R和3′DNA尾cON-D，用于AON杂交和RNase H切割
- 参考探针：生物素化DNA寡核苷酸BdTG15（biotin-(TEG)2-5′-d(TGG)5-3′），用于参考通道补偿折射率变化和非特异结合
- 下游捕获探针：生物素化DNA寡核苷酸BdTG25（biotin-(TEG)2-5′-d(TGG)8T-3′），与cON-D片段互补，捕获切割产物
- 信号放大元件：cON的3′DNA尾（cON-D，7/15/25 nt）增加切割片段质量，提高SPR响应
中文摘要
本研究报道了一种用于监测核糖核酸酶H（RNase H）活性的双通道表面等离子共振（SPR）检测方法。该方法利用多通道SPR生物传感器，在同一流路中设置两个独立功能化传感区：上游传感区固定含RNA底物和DNA尾的嵌合寡核苷酸探针，用于实时监测RNase H对RNA链的切割；下游传感区固定特异性DNA探针，用于捕获切割反应释放的片段。通过优化反义寡核苷酸（AON）浓度和反应温度，并采用含较长脱氧核糖核苷酸尾的嵌合探针，可显著增强SPR信号。结果表明，RNase H在切割前可稳定RNA:DNA杂交双链。该双通道方法无需对AON进行标记，可同时获得酶活性和切割产物信息，并用于评价天然及修饰寡核苷酸激活RNase H的能力。
英文摘要
There is a demand for efficient tools for the monitoring of RNase H activity. We report on a new assay which allows for simultaneous (1) real-time monitoring of RNase H activity and (2) detection of cleavage reaction products. The dual assay is implemented using a multichannel surface plasmon resonance (SPR) biosensor with two independently functionalized sensing areas in a single fluidic path. In the first sensing area the RNA cleavage by RNase H is monitored, while the products of the cleavage reaction are captured in the second sensing area with specific DNA probes. The assay was optimized with respect to AON concentration and temperature. A significant improvement was obtained with special chimeric probes, which contain RNA substrate for RNase H and a longer deoxyribonucleotide tail, which enhances the SPR signal. It has been shown that RNase H stabilizes the RNA:DNA hybrid duplex before the cleavage. The potential of the assay is demonstrated in the study in which the ability of natural and modified oligonucleotides to activate RNase H is examined.