组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
蛋白激酶A活性（Protein Kinase A activity, PKA activity）；样品基质：HEK293活细胞质膜微区（膜筏与非筏区）
检测原理
AKAR4由Cerulean、PKA替代底物、PAABD和YFP串联组成，并通过Lyn或K-Ras脂锚定模块分别定位到质膜膜筏或非筏区。当β-AR激动剂异丙肾上腺素（Iso）或腺苷酸环化酶激动剂佛诺斯林（Fsk）激活cAMP/PKA通路时，PKA磷酸化AKAR4中的替代底物；磷酸化底物被PAABD结合，引起供体与受体间距离或取向改变，FRET效率升高，表现为YFP/Cerulean发射比增加。H89抑制PKA后，内源磷酸酶使底物去磷酸化，FRET下降，发射比回落。该传感器以FRET比值为自参照读出，提高信噪比，可实时反映局部PKA活性变化。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数；报告响应幅度：AKAR4对Iso刺激的发射比变化为58 ± 1.7% (n = 7)，较AKAR3提高67%；Lyn-AKAR4与AKAR4-Kras对Iso的发射比变化分别为9.4 ± 0.8% (n = 45)和9.4 ± 1.4% (n = 23)。
效应效果
AKAR4较AKAR3动态范围提高67%，对Iso响应58±1.7%(n=7)。膜靶向版本对Iso响应约9.4%(n=45/23)。MbCD破坏膜筏后，β-AR刺激响应增强78%(Lyn-AKAR4 17.5±2.8%,n=7)和88%(AKAR4-Kras 18.3±1.8%,n=5)。静息H89使Lyn-AKAR4下降12.0±0.8%(n=59)，AKAR4-Kras仅2.8±0.5%(n=26)。作者认为该方法可区分质膜微区PKA动态，揭示膜筏负调控β-AR刺激PKA并维持基础活性。
传感器的构成
- 荧光供体：Cerulean（CFP变体），替代AKAR3中的eCFP，提供青色荧光并作为FRET供体。
- 荧光受体：YFP（黄色荧光蛋白），与Cerulean组成FRET对，PKA活性升高时黄/青发射比增加。
- 识别元件：PKA替代底物（surrogate substrate，含可磷酸化Thr）与磷酸氨基酸结合域（PAABD），响应PKA磷酸化并发生构象变化。
- 膜筏靶向模块：Lyn激酶N端衍生序列GCIKSKRKDK，经肉豆蔻酰化/棕榈酰化将Lyn-AKAR4靶向质膜膜筏。
- 非筏靶向模块：K-Ras衍生序列KKKKKKSKTKCVIM（CaaX/多赖氨酸），经法尼基化将AKAR4-Kras锚定非筏质膜。
- 表达/成像基底：pcDNA3载体转染HEK293细胞，玻璃盖玻片培养，用于活细胞FRET成像。
- 信号读出：Axiovert 200M荧光显微镜配CCD相机，420DF20激发、450DRLP二向色镜、475DF40/535DF25发射滤片，输出黄/青发射比。
中文摘要
膜筏是富含鞘脂和胆固醇的质膜微区，其中动态排列多种信号蛋白。cAMP/蛋白激酶A（PKA）通路的多个组分，包括β-肾上腺素受体（β-AR）、G蛋白和腺苷酸环化酶（AC），在膜筏与非筏区域呈差异定位。由于PKA参与调控多种基本细胞功能，且许多功能依赖膜筏，理解PKA活性如何被这些质膜微区特异性调节具有重要意义。为此，作者开发了改进的FRET基PKA活性生物传感器，并将其靶向质膜的膜筏和非筏区域，以观察不同质膜微区中PKA活性的动态变化。胆固醇耗竭破坏膜筏可增强β-AR刺激的质膜PKA活性，提示膜筏在β-AR刺激PKA激活中起负调控作用。此外，静息状态下膜筏比非筏区域具有更高的基础PKA活性，且该活性依赖膜筏完整性和PKA的正确定位。本研究证明膜筏在调节质膜PKA活性中发挥重要作用，并表明活细胞FRET检测能够揭示质膜微区之间的动态差异，为解析膜调控信号转导奠定基础。
英文摘要
Membrane rafts are sphingolipid- and cholesterol-rich microdomains that contain dynamic arrangements of signaling proteins. Notably, various components of the ubiquitous cAMP/Protein Kinase A (PKA) pathway, including β-adrenergic receptors (β-ARs), G proteins, and adenylyl cyclases (ACs), have been shown to localize differentially between membrane rafts and non-raft regions of the plasma membrane. As PKA participates in regulating diverse fundamental cellular functions, a number of which require membrane rafts, it is important to understand how PKA activity is specifically regulated in these membrane microdomains. To this end, we developed an improved FRET-based PKA activity biosensor, and targeted it to both membrane raft and non-raft regions of the plasma membrane to examine PKA activity dynamics in different plasma membrane microdomains. Disruption of membrane rafts via cholesterol depletion was shown to enhance β-AR stimulated PKA activity at the plasma membrane, suggesting that membrane rafts play a negative role in β-AR stimulated PKA activation. Furthermore, we found that membrane rafts possess higher basal PKA activity in the resting state compared to non-raft regions, which depends on the integrity of membrane rafts and proper localization of PKA. This study shows that membrane rafts play an important role in regulating the activity of PKA at the plasma membrane, and demonstrates the ability of live-cell FRET-based assays to reveal dynamic differences amongst plasma membrane microdomains, laying a foundation for further dissection of membrane regulated signal transduction.