组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
人促红细胞生成素（EPO）、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）；样品基质：PBS 缓冲液（文中亦讨论尿液、细胞培养上清、血清等生物样品基质）
检测原理
金膜表面经 MUA 自组装形成羧基层，EDC/NHS 活化后共价固定 EPO 或 GM-CSF 单克隆捕获抗体，BSA 封闭降低非特异吸附。目标蛋白与捕获抗体特异性结合形成夹心免疫复合物。随后注入经 EDC/NHS 偶联多克隆或单克隆抗体的羧基化多壁 CNT 复合物，CNT 表面用氨基葡聚糖封闭以减少疏水非特异吸附。CNT 大分子质量结合到抗原-抗体界面，使 SPR 界面质量浓度显著增加，引起表面等离子体共振角偏移和共振单位（RU）变化。BIAcore X 在 PBS 流动相中实时监测该光学信号。由于 CNT 提供质量放大，SPR 角偏移与抗原浓度对数呈线性，信号随 EPO/GM-CSF 浓度升高而增大，从而扩展动态范围并提高低浓度检测能力。
检测灵敏度
线性范围: 0.1–1000 ng/ml；相关系数: 0.98（EPO）、0.96（GM-CSF）；灵敏度斜率: >0.30（CNT-单克隆抗体复合物）；信号放大: 31-fold；可检测更低浓度: <0.1 ng/ml
效应效果
该方法通过优化芯片与 CNT 封闭显著降低非特异吸附：BSA 对固定单克隆抗体后的芯片表面封闭效果较好，氨基葡聚糖对 CNT–抗体复合物封闭效果较好。SEM 显示 CNT 尺寸约 0.3–1.3 μm，与抗原结合均匀，表明分散性和特异性良好。与未放大直接 SPR 相比，CNT 辅助免疫分析信号放大 31 倍，且线性相关更好；EPO 和 GM-CSF 在 0.1–1000 ng/ml 范围内 SPR 角偏移与浓度对数线性相关系数分别为 0.98 和 0.96，CNT–单克隆抗体复合物斜率 >0.30，灵敏度高于 CNT–多克隆抗体复合物。作者认为其可拓展至五个数量级并检测 <0.1 ng/ml，适用于生物制药工艺监控和多蛋白分析。
传感器的构成
- 基底/换能器：金膜玻璃片（gold-coated glass plate），作为 SPR 换能基底并承载表面等离子共振信号
- 自组装单分子层：11-巯基十一烷酸（MUA）SAM，在金表面形成羧基功能化层，用于抗体共价固定
- 活化层：EDC/NHS 活化 MUA 羧基，形成可反应位点，用于固定捕获抗体
- 识别元件：EPO 或 GM-CSF 单克隆抗体（MAb），固定于芯片表面，特异性捕获目标蛋白
- 封闭剂：1% 牛血清白蛋白（BSA）封闭芯片表面，减少非特异吸附；乙醇胺（ethanolamine）灭活未反应酯
- 信号标记/放大元件：羧基化多壁碳纳米管（multiwalled CNT）与多克隆抗体（pAb）或单克隆抗体（MAb）偶联的 CNT–抗体复合物，结合抗原后提供大质量信号放大
- CNT 封闭剂：氨基葡聚糖（amino dextran）封闭 CNT 表面，降低疏水性和非特异吸附
- 读出系统：BIAcore X SPR 生物传感器系统，PBS 流动相，监测 SPR 角偏移/共振单位（RU）
中文摘要
本文报道了一种利用抗体–碳纳米管（CNT）偶联物放大表面等离子共振（SPR）免疫分析信号的方法。以人促红细胞生成素（EPO）和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）为模型，采用夹心免疫分析在 SPR 生物传感器上进行检测。为放大 SPR 信号，将多克隆抗体与 CNT 偶联，再使其与固定于芯片上的捕获抗体所结合的目标蛋白反应。该策略扩大了免疫分析动态范围并提高检测灵敏度。结合 CNT 辅助信号放大的 SPR 免疫分析对 EPO 和 GM-CSF 均获得超过四个数量级的宽动态范围（0.1–1000 ng/ml），并有望实现皮克级检测及多种蛋白的宽动态范围分析，为生物制药生产过程中的质量控制和工艺开发提供稳健分析工具。
英文摘要
We describe a method of amplifying the biosensing signal in surface plasmon resonance (SPR)-based immunoassays using an antibody-carbon nanotube (CNT) conjugate. As a model system, human erythropoietin (EPO) and human granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) were detected by sandwich-type immunoassays using an SPR biosensor. For the amplification of the SPR signal, the CNT was conjugated with a polyclonal antibody, and then the conjugates were reacted with antibodies coupled with the target proteins. This amplification strategy increases the dynamic range of the immunoassays and enhances the detection sensitivity. The SPR immunoassays, combined with the CNT-assisted signal amplification method, provided a wide dynamic range over four orders of magnitude for both EPO and GM-CSF (0.1-1,000 ng/ml). The CNT amplification method is expected to realize the detection of picogram levels and a wide dynamic detection range of multiple proteins, enabling it to offer a robust analysis tool for the development of biopharmaceutical production.