组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
互补单链DNA（complementary single-strand DNA, cDNA），样品基质：缓冲液（0.5 mM Tris-HCl pH 8.0，杂交用5×SSC）
检测原理
PAA纳米通道内壁固定中性吗啉代探针，初始表面近中性，Fe(CN)6^3-在浓度梯度下扩散通过通道并在Au电极上还原，稳态电流正比于自由扩散面积。目标cDNA与吗啉代杂交形成带负电DNA-吗啉代双链，在通道内形成静电排斥区并伴随双链位阻，排斥Fe(CN)6^3-，降低有效扩散面积A，使稳态还原电流下降。电流下降率δ=1-I/I0随cDNA浓度增加而增大；低离子强度下Debye屏蔽长度增大，静电排斥更强，信号更明显。通过比较中性、负电、正电探针，确认静电排斥主导。无标记、无酶放大，依赖纳米通道受限空间放大界面电荷效应。
检测灵敏度
LOD: 0.1 nM
效应效果
该传感器在20 nm PAA通道中对100 nM互补cDNA产生约90%稳态电流下降，非互补DNA无信号变化，显示良好选择性；40 nm通道δ约47%，100 nm无变化。不同探针比较中，中性HQ δ约4%，Fe(CN)6^3-约33.3%，正电Ru(NH3)6^3+ δ为-7%，说明负电探针更敏感。响应时间约50 s，Au膜电极常规使用2周仍稳定。9 M尿素可使信号恢复，但反复变性后难以完全再生。检出限10^-10 M，与14 nm金纳米管PNA光学法相当。作者认为可用于临床诊断和生命科学。
传感器的构成
- 基底/纳米通道阵列：多孔阳极氧化铝(PAA)膜，20 nm孔径、60 μm厚，提供高密度受限纳米通道
- 硅烷偶联层：3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，在PAA内壁引入氨基
- 交联固定层：戊二醛(glutaraldehyde)，与APTES氨基反应并共价结合吗啉代末端氨基
- 识别元件：氨基吗啉代寡核苷酸(aminated morpholino, 25mer)，固定于通道内壁捕获目标DNA
- 封闭剂：丙胺(propylamine)，封闭残余醛基
- 信号探针/电活性离子：三氰化铁(III)根离子Fe(CN)6^3-（K3Fe(CN)6），作为电活性探针离子提供扩散通量
- 换能电极：溅射金膜(Au film, 100 nm)位于PAA 200 nm侧，作为工作电极检测Fe(CN)6^3-还原电流
- 电化学池/读出：PET/PDMS夹持双半池，Pt对电极、Ag/AgCl参比电极，CHI 900电化学工作站
中文摘要
本文提出一种无标记寡核苷酸（DNA）分析策略，通过测量DNA-吗啉代杂交所阻碍的探针离子Fe(CN)6^3-在多孔阳极氧化铝（PAA）膜纳米通道中的扩散通量来实现。Fe(CN)6^3-穿过PAA纳米通道的通量由溅射在纳米通道末端的金膜电化学检测器记录。纳米通道内端接的吗啉代与DNA杂交后形成带负电的DNA-吗啉代复合物，阻碍Fe(CN)6^3-在纳米通道中的扩散，导致通量下降。该通量强烈依赖于离子强度、纳米通道孔径和目标DNA浓度，表明受限纳米通道中存在位阻效应与静电排斥效应的协同作用。进一步比较不同电荷探针通过纳米通道的通量，证实探针离子与DNA之间的静电效应主导了受阻扩散过程。在最优条件下，该纳米通道阵列DNA生物传感器的检出限为0.1 nM。
英文摘要
A strategy for label-free oligonucleotide (DNA) analysis has been proposed by measuring the DNA-morpholino hybridization hindered diffusion flux of probe ions Fe(CN)(6)(3-) through nanochannels of a porous anodic alumina (PAA) membrane. The flux of Fe(CN)(6)(3-) passing through the PAA nanochannels is recorded using an Au film electrochemical detector sputtered at the end of the nanochannels. Hybridization of the end-tethered morpholino in the nanochannel with DNA forms a negatively charged DNA-morpholino complex, which hinders the diffusion of Fe(CN)(6)(3-) through the nanochannels and results in a decreased flux. This flux is strongly dependent on ionic strength, nanochannel aperture, and target DNA concentration, which indicates a synergetic effect of steric and electrostatic repulsion effects in the confined nanochannels. Further comparison of the probe flux with different charge passing through the nanochannels confirms that the electrostatic effect between the probe ions and DNA dominates the hindered diffusion process. Under optimal conditions, the present nanochannel array-based DNA biosensor gives a detection limit of 0.1 nM.