组成图示
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传感器类型
比色生物传感器
检测对象
鼠疫杆菌 F1 抗原（Yersinia pestis F1 antigen）；样品基质为 F1 抗原标准品/包被微孔板体系（原文未明确临床基质）
检测原理
F1 抗原包被于酶标微孔板，经牛奶封闭后与特异性一抗结合。自生物素化 bFPNw 的 SPG 结构域结合一抗 Fc 段，将纳米线锚定到抗原-抗体复合物。bFPNw 由 Sup35-BAP 纳米线诱导 Sup35-SPG 单体自组装形成，其表面 BAP 经 BirA 原位生物素化，携带大量生物素。SA-HRP 通过生物素-链霉亲和素高亲和结合到纳米线表面，使每个抗原-抗体复合物负载数百个 HRP。HRP 催化 TMB 显色，450 nm 吸光度随 F1 抗原浓度增加而升高。信号放大来自蛋白纳米线的高酶/识别分子比和生物素-亲和素多重结合，而非 HCR/RCA 等核酸放大。
检测灵敏度
LOD: 0.1 ng/ml (6 pmol/l)；OD cut-off value: 0.2；S/N: ≥2；传统ELISA LOD: 200 ng/ml；auto-biotinylated bFPNws LOD: 0.1–0.05 ng/ml；灵敏度提高: 2000- to 4000-fold
效应效果
与作者此前诱导种子型 bFPNw 相比，自生物素化 bFPNw 信号更强、背景更低、稳定性更好。商品化 HRP 使显色时间缩短至 1 min 以内；离心分离去除未组装/错误组装组分；SPG 不受超声影响，可耐受更强洗涤，降低背景。F1 抗原检测中，LOD 为 0.1 ng/ml（6 pmol/l），OD 截止值 0.2、S/N≥2；传统 ELISA LOD 约 200 ng/ml，本方法降至 0.1–0.05 ng/ml，灵敏度提高 2000–4000 倍。作者认为其可用于超灵敏分子生物传感，但仍需提高纳米线均一性并减少非特异吸附。
传感器的构成
- 基底/捕获界面：酶标微孔板（microplate），F1 抗原包被，提供抗原固定与免疫反应界面
- 封闭层：5% 牛奶（milk），封闭微孔板非特异结合位点，降低背景
- 识别元件（一抗）：F1 抗原特异性一抗（primary antibody），结合包被的 F1 抗原
- 识别元件（蛋白 G）：链球菌蛋白 G 的 C1 结构域（SPG），融合于 bFPNw 末端，结合一抗 Fc 段
- 纳米线骨架/修饰层：自生物素化双功能蛋白纳米线（bFPNw），由 Sup35-BAP 纳米线诱导 Sup35-SPG 单体自组装形成；Sup35 淀粉样蛋白 prion domain 驱动纤维化，BAP 经 BirA 原位生物素化
- 信号标记物：链霉亲和素-辣根过氧化物酶聚合物（SA-HRP），通过生物素—链霉亲和素结合到 bFPNw 表面生物素，携带 HRP
- 显色底物与读出：TMB 液体底物系统，HRP 催化 TMB 显色，450 nm 吸光度由微孔板读数仪（microplate reader）读取
中文摘要
为获得超灵敏分子生物传感器，作者基于酵母淀粉样蛋白 Sup35 的自组装设计了一种自生物素化双功能蛋白纳米线（bFPNw），在该蛋白上遗传融合蛋白 G（protein G）和生物素受体肽（BAP）。在 BirA 生物素连接酶作用下，BAP 在表达过程中被原位生物素化，使纳米线表面携带大量生物素。这些自生物素化 bFPNw 可通过生物素—亲和素/链霉亲和素系统将数百个商品化诊断酶（如 HRP）连接到抗原—抗体复合物上，从而显著增强免疫生物传感信号。与作者此前报道的诱导种子型 bFPNw 相比，自生物素化 bFPNw 具有更强的信号放大、更低的非特异性结合和更好的稳定性。将该自组装 bFPNw 分子生物传感器用于鼠疫杆菌（Yersinia pestis）F1 抗原检测，其灵敏度较传统免疫检测方法提高 2000–4000 倍，表明自组装蛋白纳米线在生物传感中的应用潜力。
英文摘要
In order to obtain an ultra-sensitive molecular biosensor, we designed an auto-biotinylated bifunctional protein nanowire (bFPNw) based on the self-assembly of a yeast amyloid protein, Sup35, to which protein G and a biotin acceptor peptide (BAP) were genetically fused. These auto-biotinylated bFPNws can transfer hundreds of commercially available diagnostic enzymes to an antigen-antibody complex via the biotin-avidin system, greatly enhancing the sensitivity of immune-biosensing. Compared to our previously reported seeding-induced bFPNws (Men et al., 2009), these auto-biotinylated bFPNws gave greater signal amplification, reduced non-specific binding and improved stability. The auto-biotinylated self-assembled bFPNw molecular biosensors were applied to detect Yersinia pestis (Y. pestis) F1 antigen and showed a 2000- to 4000-fold increase in sensitivity compared to traditional immunoassays, demonstrating the potential use of these self-assembling protein nanowires in biosensing.