组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
凝集素（jacalin、WGA），样品基质为 HEPES 运行缓冲液（10 mM HEPES、150 mM NaCl、1 mM CaCl2、0.005% P20、pH 7.4）
检测原理
CM5 芯片经 EDCI/NHS 活化、EDA 胺化、叠氮乙酸-NHS 酯叠氮化，形成稳定叠氮表面；膦修饰糖配体通过 Staudinger 偶联共价固定，生成 Gal、Lac 和 LacNAc 表位层。当 jacalin 或 WGA 流过时，凝集素与表面糖表位特异性结合，结合质量增加改变表面等离子体共振条件，BIAcore 3000 记录响应单位 RU 随时间变化。稳态 RU 随凝集素浓度升高而增加，可拟合结合等温线获得 Kd。WGA 为四聚体，高密度 LacNAc 表面可桥接多个结合位点，产生多价/螯合结合，使表观亲和力增强约30倍；生物素对照表面用于扣除非特异/体积响应。无外源标记，SPR 直接质量传感。
检测灵敏度
r2 = 0.98（jacalin 单点模型）；r2 = 0.99（jacalin 双点模型）；r2 = 0.82（WGA 单点模型）；r2 = 0.88（WGA 双点模型）
效应效果
该 SPR 表面具有良好选择性：jacalin 仅特异性结合含半乳糖的化合物 2，WGA 仅结合含 GlcNAc 的 LacNAc 化合物 4，乳糖表面无特异结合，生物素对照仅显示体积响应。叠氮表面稳定，可避免膦试剂氧化，并减少昂贵膦试剂用量。平衡结合显示 jacalin 对 β-半乳糖苷单点 Kd 为 800 ± 70 μM，Bmax 55 ± 1 RU；WGA 对 LacNAc 单点 Kd 为 190 ± 40 μM，Bmax 111 ± 4 RU。双点拟合提示 WGA 存在多价结合，高密度表位可桥接四聚体多个位点，使表观亲和力增强约30倍。方法条件温和，兼容商业 BIAcore 3000，可用于凝集素-糖链相互作用定量和表位呈现研究。
传感器的构成
- 基底/换能器：CM5 羧甲基葡聚糖（CMD）SPR 芯片，提供羧基表面并承载 SPR 信号
- 活化层：EDCI/NHS 活化羧基，形成可反应活化酯
- 胺修饰层：乙二胺（EDA）接枝，引入表面氨基
- 叠氮修饰层：叠氮乙酸-NHS 酯（5）与氨基反应，形成稳定叠氮表面
- 识别/配体层：膦修饰碳水化合物配体（2 Gal、3 Lac、4 LacNAc）通过 Staudinger 偶联固定，作为凝集素识别表位
- 对照层：生物素标记膦化合物（1）用于背景扣除
- 读出介质：HEPES 运行缓冲液（10 mM HEPES、150 mM NaCl、1 mM CaCl2、0.005% P20、pH 7.4），维持结合并传输 SPR 信号
中文摘要
糖蛋白相互作用检测常需将凝集素或糖链固定于表面，表面等离子共振（SPR）是常用方法。本文报道利用 Staudinger 偶联将碳水化合物表位固定到 SPR 生物传感器表面。首先用 EDCI/NHS 活化 CM5 羧甲基葡聚糖芯片，经乙二胺（EDA）胺化后与叠氮乙酸-NHS 酯反应，生成稳定叠氮化表面；随后注入膦修饰糖配体，通过 Staudinger 偶联固定半乳糖、乳糖和 N-乙酰乳糖胺表位。反应条件温和，兼容商业 BIAcore 3000 系统。利用该表面研究 jacalin 和 WGA 对 Gal、Lac 和 LacNAc 的结合。结果显示 jacalin 特异性结合含半乳糖表面，WGA 特异性结合含 GlcNAc 的 LacNAc 表面；WGA 结合呈现多价相互作用证据，高密度表位可桥接 WGA 四聚体多个位点；jacalin 对 β-半乳糖苷的结合高于预期，分子模拟表明柔性疏水苷元可进入蛋白疏水次级位点 A，提供额外疏水作用。该方法为 SPR 糖链固定提供温和、稳定且可商用的新策略。
英文摘要
The detection of carbohydrate-protein interactions is often performed using techniques that require surface immobilization of the lectin or the glycan. A commonly used assay for lectin binding is surface plasmon resonance (SPR). We describe an implementation of the Staudinger ligation as a method to immobilize carbohydrate epitopes to a biosensor surface. This was accomplished by first introducing an azide functionality to a carboxymethyldextran surface, followed by reaction with a phosphane-modified carbohydrate ligand. The chemistry employed is extremely mild and was easily adapted to a commercial biosensor system. Using this approach, we investigated the binding of jacalin and wheat germ agglutinin (WGA) to galactose, lactose, and N-acetyl-lactosamine. We observed that WGA binding shows evidence of multivalent interaction with the surface. Additionally, we found that jacalin binding was influenced by the presence of a flexible and hydrophobic galactosyl aglycone.