组成图示
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传感器类型
综述或非传感器论文
检测对象
磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI4P）、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PI(4,5)P2）；样品基质：酿酒酵母细胞质膜/细胞内
检测原理
该研究使用荧光脂质相关报告蛋白（FLARE）监测酵母细胞内 PI4P 的亚细胞分布。GFP-2XPHOsh2 中的串联 Osh2p PH 结构域识别并结合 PI4P；当肌醇饥饿或 AbA/myriocin 抑制含肌醇鞘脂合成时，质膜上 Stt4p 依赖的 PI4P 池可及性增加，探针由主要位于高尔基体转向质膜富集，GFP 荧光在质膜增强。PI(4,5)P2 探针 GFP-2XPHPLCγ1 作为对照，其质膜分布基本不变。Stt4p 将 PI 磷酸化为 PI4P，Mss4p 进一步生成 PI(4,5)P2；这些脂质招募/激活 Rom2p 等效应蛋白，最终引起 Slt2p 磷酸化。荧光显微镜读出 PI4P 探针的质膜富集，作为 PKC 激活的标记。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
探针在四个不同遗传背景的野生型酵母中均能在肌醇饥饿后约 60 min 出现质膜 PI4P 富集，120 min 增强；加回肌醇后 10–15 min 减弱。stt4ts 在限制温度下完全缺失质膜 PI4P，而 pik1ts 与野生型相似，说明信号依赖 Stt4p 而非 Pik1p。44 个突变体中，仅 stt4ts 和 mss4ts 完全缺失该信号，且二者呈肌醇营养缺陷型但 INO1 正常去抑制。AbA 或 myriocin 处理使 >90% 细胞出现质膜 PI4P 并诱导 Slt2p 磷酸化；外源 DHS/PHS 不能诱导 PKC 激活。作者主张该 PI4P 荧光探针可作为 PKC 激活和含肌醇鞘脂代谢扰动的细胞内标记。
传感器的构成
- 荧光报告蛋白：GFP 或 mCherry，提供可成像荧光信号
- 识别元件：酵母 Osh2p 串联 PH 结构域（2XPHOsh2），特异性结合 PI4P
- 识别元件：哺乳动物 PLCγ1 串联 PH 结构域（2XPHPLCγ1），结合 PI(4,5)P2
- 质膜靶向/磷酸酶对照：GFP-Sac1ΔC-2XPHPLCγ1，含 Sac1p 磷酸酶域与 PLCγ1 PH 域，用于靶向质膜并降低 PI4P/PI(4,5)P2
- 表达载体：2μ 质粒 pRS426、pRS416、pRS425，由 PRC1 启动子驱动探针表达
- 样品基质：酿酒酵母细胞，主要监测质膜与高尔基体区室
中文摘要
蛋白激酶C（PKC）-MAPK 信号级联在酿酒酵母缺乏磷脂前体肌醇时被激活，并对细胞存活至关重要。本研究报道，通过肌醇饥饿或使用阻断鞘脂合成的试剂抑制含肌醇鞘脂代谢，可在不依赖鞘碱（DHS 和 PHS）积累的情况下触发 PKC 信号。在相同生长条件下，用于检测 PKC 信号必需中间产物磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI4P）的荧光生物传感器在质膜上富集。PI4P 探针出现在质膜上与 PKC 激活相关，并依赖 PI 4-激酶 Stt4p。与 PKC-MAPK 通路其他突变体类似，Stt4p 和 PI4P 5-激酶 Mss4p 缺陷突变体表现出肌醇营养缺陷型，但 INO1 仍完全去抑制。这些结果提示，含肌醇鞘脂代谢通过调控信号脂质 PI4P 和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PI(4,5)P2）与质膜效应蛋白的可及性，从而控制 PKC 信号。
英文摘要
The protein kinase C (PKC)-MAPK signaling cascade is activated and is essential for viability when cells are starved for the phospholipid precursor inositol. In this study, we report that inhibiting inositol-containing sphingolipid metabolism, either by inositol starvation or treatment with agents that block sphingolipid synthesis, triggers PKC signaling independent of sphingoid base accumulation. Under these same growth conditions, a fluorescent biosensor that detects the necessary PKC signaling intermediate, phosphatidylinositol (PI)-4-phosphate (PI4P), is enriched on the plasma membrane. The appearance of the PI4P biosensor on the plasma membrane correlates with PKC activation and requires the PI 4-kinase Stt4p. Like other mutations in the PKC-MAPK pathway, mutants defective in Stt4p and the PI4P 5-kinase Mss4p, which generates phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, exhibit inositol auxotrophy, yet fully derepress INO1, encoding inositol-3-phosphate synthase. These observations suggest that inositol-containing sphingolipid metabolism controls PKC signaling by regulating access of the signaling lipids PI4P and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate to effector proteins on the plasma membrane.