组成图示
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传感器类型
综述或非传感器论文
检测对象
ELMO2 构象状态（ELMO2 conformational state）；样品基质：HEK293T 活细胞
检测原理
该 BRET2 构象探针将 RlucII 融合于 ELMO2 C 端、GFP10 融合于 N 端。在自抑制状态下，ELMO2 的 EID 与 EAD 相互作用使 N、C 端靠近，DeepBlue C 激发 RlucII 后，其 400 nm 生物发光通过共振能量转移被 GFP10 接收，产生 510 nm 荧光，BRET2 比值升高。当 EID/EAD 界面被突变破坏，或 ELMO2 与 DOCK180 结合时，蛋白转为开放构象，两端距离增大，能量转移效率下降，BRET2 信号降低。RhoG 结合 RBD 理论上也可竞争 EAD 结合并解除自抑制，但大标签影响结合，文中未能直接证实。因此信号变化反映 ELMO2 构象而非蛋白浓度。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
BRET2 信号不随 ELMO2 表达浓度变化，说明检测的是分子内相互作用而非寡聚。EID 突变 ELMO2 I196D 或 L194E/I196D/L197E 使 BRET2 比值显著下降（p<0.001），提示开放构象；RBD 突变 L43A 不影响 BRET2，说明该突变不直接改变自抑制界面。DOCK180 与探针结合后促进构象开放，BRET2 降低。功能实验中，ELMO1 I204D 和 M692A/E693A 等自抑制缺陷突变体与 RhoGV12 共表达时显著促进细胞伸长，Feret 直径增加，且细胞迁移提高超过 2 倍；该表型依赖 DOCK180 结合。对照突变 Y216F 和 R697A/L698A/L699A 不改变表型，显示特异性。
传感器的构成
- 基底/换能器：HEK293T 活细胞质/细胞膜，提供 ELMO2 表达与膜定位环境。
- 识别元件：全长 ELMO2 蛋白，含 RBD、EID（HEAT+ARR）和 EAD，作为构象传感主体。
- 信号供体：Renilla 海肾荧光素酶 RlucII，融合于 ELMO2 C 端，受 DeepBlue C 激发发射 400 nm 生物发光。
- 信号受体：GFP10 荧光蛋白，融合于 ELMO2 N 端，接收 RlucII 能量后发射 510 nm 荧光。
- 激发剂：DeepBlue C，激发 RlucII 产生生物发光。
- 识别/调控界面：ELMO2 EID 与 EAD 相互作用界面，维持自抑制构象，结合 RhoG/DOCK180 或突变后开放。
- 读出：BRET2 比值（510 nm/400 nm），反映 ELMO2 两端距离与构象状态。
中文摘要
细胞迁移、吞噬和肌细胞融合过程中，细胞因子奉献蛋白（DOCK）作为鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）调控 Rac1/Cdc42 活性。吞噬与细胞运动蛋白（ELMO）可结合部分 DOCK 成员，并逐渐成为 Rac 信号的关键调控因子。尽管 DOCK180/ELMO 复合物的形成并非 Rac1 激活所必需，但无法结合 DOCK180 的 ELMO 突变体不能促进细胞骨架重塑。ELMO 如何通过 DOCK GEF 调控信号仍不清楚。本研究在 ELMO 中鉴定出一个与 Dia 形影蛋白调控单元同源的自抑制开关：其一部分由 N 端 Ras 结合域（RBD）和 Armadillo 重复序列组成，另一部分位于 C 端。作者证明这两个片段可相互作用，提示 ELMO 存在自抑制。利用生物发光共振能量转移（BRET）生物传感器，作者发现破坏自抑制后 ELMO 发生构象变化。ELMO 与 RhoG 或 DOCK180 结合可解除自抑制。功能上，自调控活性受损的 ELMO 突变体促进细胞伸长。结果表明，ELMO 自抑制为 Rac1 信号提供了一种此前未被认识的调控层次。
英文摘要
Dedicator of cytokinesis (DOCK) proteins are guanine nucleotide exchange factors (GEFs) controlling the activity of Rac1/Cdc42 during migration, phagocytosis, and myoblast fusion [1-4]. Engulfment and cell motility (ELMO) proteins bind a subset of DOCK members and are emerging as critical regulators of Rac signaling [5-10]. Although formation of a DOCK180/ELMO complex is not essential for Rac1 activation, ELMO mutants deficient in binding to DOCK180 are unable to promote cytoskeleton remodeling [11]. How ELMO regulates signaling through DOCK GEFs is poorly understood. Here, we identify an autoinhibitory switch in ELMO presenting homology to a regulatory unit described for Dia formins. One part of the switch, composed of a Ras-binding domain (RBD) and Armadillo repeats, is positioned N-terminally while the other is housed in the C terminus. We demonstrate interaction between these fragments, suggesting autoinhibition of ELMO. Using a bioluminescence resonance energy transfer biosensor, we establish that ELMO undergoes conformational changes upon disruption of autoinhibition. We found that engagement of ELMO to RhoG, or with DOCK180, promotes the relief of autoinhibition in ELMO. Functionally, we found that ELMO mutants with impaired autoregulatory activity promote cell elongation. These results demonstrate an unsuspected level of regulation for Rac1 signaling via autoinhibition of ELMO.