组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
四环素类（tetracyclines，包括 tetracycline、doxycycline、anhydrotetracycline）；样品基质：缓冲液标准品，目标为生物基质与食品
检测原理
该传感器采用无标记间接竞争 SPR 原理。芯片表面通过 EDC/NHS 共价固定多西环素衍生物 DOX-5/8/11，作为 TetR 的结合竞争物。检测时，样品中的四环素类在含 Mg2+ 的缓冲液中先与 TetR 结合；由于 Mg2+ 对 TetR-四环素结合必需，TetR 的配体结合位点被占据后，其结合固定多西环素衍生物的能力下降。若样品无四环素，TetR 可结合固定 DOX 衍生物，使芯片表面质量增加，SPR 共振信号（RU）升高；四环素浓度越高，TetR 被占据越多，表面结合量越低，RU 信号呈负相关。系统通过监测 RU 变化间接定量四环素，未使用酶或荧光放大，主要依赖 TetR 的高亲和识别（Ka 约 10^9 M^-1）和 SPR 实时质量传感。
检测灵敏度
—
效应效果
CM5 芯片非特异性结合最低、TetR 结合 60 min 内稳定，CMDP、HC1000m、CMTEG 因非特异吸附或厚层干扰不适合。无 Mg2+ 时几乎无结合，特异性较好；TetR 结合在 0.1–1.5 µM 线性。竞争实验中表面结合随四环素浓度升高而降低，三种衍生物斜率相近。衍生物结合活性为 DOX-5/8 约 53%、DOX-11 约 33%。未报告实际样品回收率；重现性差，重复注射信号下降，作者认为可作原理验证，但灵敏度不及已有方法，需优化。
传感器的构成
- SPR换能基底：金膜玻璃表面（gold-coated glass），提供表面等离子共振信号换能
- 羧基修饰层：羧甲基葡聚糖（carboxymethyl dextran, CMD/CM5，100 nm）或 CMDP、HC1000m、CMTEG，提供羧基与亲水固定环境
- 化学活化层：EDC/NHS 活化羧基生成 NHS 酯，用于与衍生物末端伯胺共价偶联
- 固定竞争配体：多西环素衍生物 DOX-5/DOX-8/DOX-11（C9 位连接 5/8/11 碳烷基 spacer 末端伯胺），作为 TetR 结合竞争物
- 封闭层：乙醇胺（ethanolamine）灭活剩余 NHS 酯，减少非特异性结合
- 识别元件：重组细菌四环素依赖调节蛋白 TetR（tetracycline-dependent regulatory protein），特异性结合四环素/多西环素衍生物
- 运行与再生介质：HBS-P 缓冲液加 5 mM MgSO4 维持 TetR-四环素结合；SDS 再生液去除表面 TetR
- 信号读出：Biacore Q SPR 系统监测响应单位（RU）变化
中文摘要
本文报道了一种用于检测生物基质和食品中低浓度四环素类化合物的新型多西环素衍生物及其表面等离子共振（SPR）竞争法应用。针对小分子分析物难以直接检测的问题，作者采用间接竞争格式，以细菌四环素依赖调节蛋白 TetR 作为高亲和识别元件（Ka 约 10^9 M^-1）。通过 C9 位修饰合成三种不同烷基间隔臂长度的多西环素衍生物 DOX-5、DOX-8 和 DOX-11，并将其共价固定于 CM5、CMDP、HC1000m 和 CMTEG 四种 SPR 芯片表面。研究考察了芯片材料、活化程度、固定 pH、衍生物浓度和间隔臂长度对固定量及 TetR 结合的影响。结果表明，CM5 芯片非特异性结合低、再生性较好，适合作为竞争 SPR 检测平台；样品中四环素与 TetR 结合后抑制 TetR 与固定多西环素衍生物的结合，从而产生与四环素浓度负相关的 SPR 信号。该工作证明了新型多西环素衍生物可作为竞争物用于间接 SPR 四环素检测，但系统重现性仍需优化。
英文摘要
BACKGROUND: This article aims to explore novel doxycycline derivatives for analyzing low concentrations of tetracyclines in biological matrices and food in competitive assays.
RESULTS: Surface plasmon resonance (SPR) was employed in an indirect competitive format using a bacterial tetracycline-dependent regulatory protein as receptor. Three doxycycline derivatives were synthesized and covalently bound to the surface of four different sensor chips. Parameters that influence the immobilization of the doxycycline derivatives and subsequent binding of the receptor protein were studied.
CONCLUSION: The novel doxycycline derivatives were successfully used as competitors in an indirect SPR assay.